PMG-36e－CD--upp重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的：為了探討自殺基因在臨床腫瘤治療中的應(yīng)用，以具有較好靶向性和安全性可以通過重組轉(zhuǎn)化厭氧菌而特異性表達(dá)于腫瘤乏氧區(qū)的表達(dá)型載體PMG36e為構(gòu)建重組質(zhì)粒的載體，選擇能將原來無毒的前體藥物代謝轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性產(chǎn)物的自殺基因-大腸桿菌/胞嘧啶脫氨酶/尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶融合基因(CD::upp)作為目的基因，利用分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)構(gòu)建PMG36e-CD::upp重組質(zhì)粒，為轉(zhuǎn)化入雙歧桿菌及靶向表達(dá)于腫瘤乏氧區(qū)并與放療聯(lián)合后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

2、 方法：用小量制備質(zhì)粒DNA的方法分別提取表達(dá)型質(zhì)粒載體PMG-36e和自殺基因pORF-CD::upp,取提取的表達(dá)型質(zhì)粒載體PMG-36e進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒回收目的條帶后用乙酸鉀沉淀法純化濃縮質(zhì)粒備用；以質(zhì)粒pORF-CD::upp為摸板擴(kuò)增CD::upp基因，設(shè)計PCR上下游引物時分別加入限制性內(nèi)切酶Sac Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位點(diǎn),PCR反應(yīng)條件為： 50μl PCR反應(yīng)體系中含模板DNA10μl，上下游引

3、物各 5μl,Taq 酶 0.5μl，dNTP(2.0mM) 5μl，10xbuffer 5μl,ddH2O19.5μl。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán):94℃變性60s,選擇溫度梯度62-66℃退火120s，72℃延伸60s,35個循環(huán)后；72℃最終延伸20min，擴(kuò)增出約為1930bp左右特異性目的片段。各取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl以選擇最適退火溫度，確定最佳退火溫度為62.4℃，進(jìn)行PCR大量擴(kuò)增后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電

4、泳，取分子量為1930bp左右片斷進(jìn)行膠回收及純化。純化后的表達(dá)型質(zhì)粒載體PMG-36e與自殺基因CD::upp分別用限制性內(nèi)切酶Sac Ⅰ與SalⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切體系為載體PMG-36e或目的基因CD::upp10μl，限制性內(nèi)切酶Sac Ⅰ與SalⅠ各1μl，10xbuffer2μl，BSA2μl，ddH2O4μl。酶切體系在37℃進(jìn)行反應(yīng)，酶切時間均為4h。終止酶切后取載體PMG-36e 2μl，目的基因coda::upp 3μ

5、l，T4DNA ligase 5μl，16℃恒溫水浴過夜連接。取連接產(chǎn)物5μl進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。取制備好的感受態(tài)菌100μl加入10μl連接產(chǎn)物(DNA<=50ng)42℃水浴2min進(jìn)行熱休克后立即冰浴2min，加入LB培養(yǎng)基800μl，37℃，200mm溫和振蕩1h后鋪板(含紅霉素150ug/ml的LB固體培養(yǎng)基)，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，篩選單克隆傳代培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒鑒定。 結(jié)果：PMG-36e-CD:

6、:upp重組質(zhì)粒用化學(xué)法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109后，提取質(zhì)粒進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳目的條帶，與標(biāo)準(zhǔn)Marker相比較分子量約為5.5Kb，與預(yù)計大小一致：取重組質(zhì)粒PMG-36e-CD::upp 10μl，限制性核酸內(nèi)切酶Sac Ⅰ與SalⅠ各1μl，10xbuffer 2μl，BSA2μl，ddH2O 4μl。酶切體系在37℃進(jìn)行反應(yīng)，酶切時間均為4h，最后65℃ 10min滅活酶。取酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳得到1.9kb(co

7、da::upp)和3.6kb(PMG-36e)片斷，與預(yù)計大小一致；以質(zhì)粒pORF-CD::upp為模板特異性擴(kuò)增CD::upp基因，PCR反應(yīng)條件為：50μlPCR反應(yīng)體系中含模板DNA10μl，上下游引物各5μl，Taq 酶 0.5μl，dNTP(2.0mM)5μl，10xbuffer 5μl，ddH2O 19.5μl。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)：94℃變性60s，62.4℃退火120s，72℃延伸 60s，35個

8、循環(huán)后；72℃最終延伸20min。擴(kuò)增出約1.9Kb的CD::upp片段。將PMG-36e-CD::upp重組質(zhì)粒送上海測序部進(jìn)行測序鑒定，所用測序儀器為ABI PRISM 3730，測序試劑為BigDye terminator v3.1；通過兩個測序反應(yīng)得到兩段堿基序列分別為979bp和959bp，分別去除測序引物并且連接后得到1758bp，將此段連接序列用DNAstar軟件分析示與GENEBANK上公布的原序列一致，無開放讀碼框架移