不同亞型神經(jīng)細胞粘附分子重組質粒的構建及鑒定.pdf

1、目的：利用RT-PCR技術制備小鼠三種亞型神經(jīng)細胞粘附分子（NeuralCell Adhesion Molecule，NCAM）的cDNA片段，然后利用基因重組技術將三種NCAMcDNA亞型克隆到質粒pcDNA4中，構建三種NCAMcDNA亞型重組質粒，為后續(xù)的不同亞型NCAM基因修飾的骨髓基質干細胞（BoneMarrow Stormal Cells，BMSCs）移植治療脊髓損傷的差異性研究做準備。方法：1.從美國國家醫(yī)學圖書館互聯(lián)網(wǎng)核

2、酸數(shù)據(jù)庫檢索到NCAM-120cDNA、NCAM-140cDNA和NCAM-180cDNA序列，設計它們的上、下游引物，預計擴增片段分別為2178bp、2547bp和3348bp。2.取成年小鼠大腦皮質提取總RNA，甲醛瓊脂糖凝膠電泳鑒定和紫外分光光度法測定后，以提取的總RNA為模板，NCAM-120、NCAM-140和NCAM-180的上、下游引物做RT-PCR，得到NCAM-120cDNA、NCAM-140cDNA和NCAM-180

3、cDNA，三種NCAMcDNA亞型經(jīng)甲醛瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，純化回收，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、HindⅢ雙酶切質粒pcDNA4及三種NCAMcDNA亞型，酶切產(chǎn)物純化回收后，在T4DNA連接酶的作用下，分別將NCAM-120cDNA、NCAM-140cDNA和NCAM-180cDNA定向插入于質粒pcDNA4的XbaⅠ、HindⅢ酶切位點之間，純化回收連接產(chǎn)物。3.用氯化鈣制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α，設置重組質粒組及空白質粒組，分別將各

4、亞型NCAM重組質粒及空白質粒pcDNA4轉入感受態(tài)大腸桿菌DH5α后，接種在含有氨芐青霉素的陽性培養(yǎng)基中大量擴增。取一部分擴增的大腸桿菌DH5α提取各亞型NCAM重組質粒及空白質粒，以提取的質粒為模板，NCAM-120、NCAM-140和NCAM-180的特異性上、下游引物做PCR鑒定，并將質粒DNA做限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定。結果：1.提取的成年小鼠大腦皮質總RNA經(jīng)甲醛瓊脂糖凝膠電泳可見18sRNA和28sRNA

5、的清晰條帶，且28sRNA條帶的亮度是18sRNA的兩倍；紫外分光光度法測定OD260/280為1.9?？俁NA未明顯降解。2.以提取的總RNA為模板，NCAM-120、NCAM-140和NCAM-180的特異性上、下游引物做RT-PCR后，甲醛瓊脂糖凝膠電泳得到2178bp、2547bp和3348bp的片段，此結果即為NCAM-120cDNA、NCAM-140cDNA和NCAM-180cDNA片段。3.成功制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α后

6、，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、HindⅢ雙酶切pcDNA4及三種NCAMcDNA亞型，用T4DNA連接酶分別將三種NCAMcDNA亞型的酶切產(chǎn)物與pcDNA4酶切產(chǎn)物連接，將連接產(chǎn)物及空白質粒轉入大腸桿菌DH5α，接種到含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長良好，見大量菌斑。4.挑取氨芐青霉素陽性培養(yǎng)基中單克隆大腸桿菌DH5α菌落，接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取菌液提取三種NCAM亞型重組質粒及空白質粒，以提取的質粒

7、為模板，NCAM-120、NCAM-140和NCAM-180的特異性上、下游引物做PCR，甲醛瓊脂糖凝膠電泳后空白質粒組未見明顯條帶，而重組質粒組分別得到2178bp、2547bp和3348bp的片段，限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、HindⅢ酶切空白質粒及重組質粒后，瓊脂糖凝膠電泳分別得到單條帶5100bp、及雙條帶5100bp和2178bp、5100bp和2547bp、5100bp和3348bp。結論：本實驗構建的pcDNA4-NCAM-12