基于芯片技術(shù)分析乳腺癌甲基化表達(dá)譜及其與基因表達(dá)關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景：
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率不斷升高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為了進(jìn)一步指導(dǎo)乳腺癌的診斷、治療和預(yù)后的判斷，尋找有效的分子生物學(xué)預(yù)測指標(biāo)一直以來都是乳腺癌臨床研究的熱點(diǎn)。近年來的研究表明，基因表觀遺傳學(xué)的改變對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響甚至超過基因突變、缺失等遺傳學(xué)的變化。DNA甲基化是最為常見的一種表觀遺傳學(xué)修飾，異常的DNA甲基化影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，可導(dǎo)致抑癌基因沉默或致癌基因活化，從而影響細(xì)胞周期的調(diào)控

2、、細(xì)胞凋亡、DNA修護(hù)和細(xì)胞粘附等過程。異常的DNA甲基化可發(fā)生在惡性腫瘤形成的初始階段，也可被DNA甲基化抑制劑所逆轉(zhuǎn)，通過改變基因甲基化狀態(tài)上調(diào)特異基因表達(dá)有可能成為腫瘤基因治療的靶點(diǎn)。因而，腫瘤DNA甲基化狀態(tài)的研究為探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制開辟了新的途徑，也是近年來腫瘤基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。
　　目的：
　　本研究通過全基因組甲基化芯片技術(shù)和表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測早期乳腺癌和正常乳腺組織的DNA甲基化及其基因的表達(dá)，初步篩選

3、乳腺癌和正常乳腺組織差異性的DNA甲基化表達(dá)指標(biāo)，并探討DNA甲基化與其基因表達(dá)的相互關(guān)系，為乳腺癌DNA甲基化研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為進(jìn)一步尋找新的乳腺癌分子標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集15例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織（T1N0M0 I期7例，T2N0M0 IIA期8例）和15例非癌患者的正常組織(乳腺炎2例，乳腺腺病2例，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤5例，纖維腺瘤6例)，上述組織標(biāo)本均經(jīng)術(shù)中和術(shù)后病理檢查確診，RN

4、Alater液保存后放入-80℃保藏備用。其中10例乳腺癌組織和正常乳腺組織用于基因芯片的檢測，另外5例乳腺癌組織和正常乳腺標(biāo)本組織用于差異基因的驗(yàn)證。
　　2.本研究采用甲基化CpG島富集分析(Methylated-CpG Island Recovery Assay，MIRA)聯(lián)合全基因組甲基化芯片技術(shù)對10例早期乳腺癌和正常乳腺標(biāo)本組織進(jìn)行檢測，初步篩選出乳腺癌和正常乳腺組織差異性的DNA甲基化表達(dá)譜；另取獨(dú)立的5例早期乳腺癌

5、和正常乳腺標(biāo)本組織，采用亞硫酸氫鹽修飾聯(lián)合直接測序法(Bisulfite Sequencing，BSP)和亞硫酸氫鹽修飾聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法（Combined Bisulfite Restriction Analysis，COBRA)對熱點(diǎn)的甲基化基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　3.采用全基因組的基因芯片對10例早期乳腺癌和正常乳腺標(biāo)本組織進(jìn)行檢測，獲得乳腺癌和正常乳腺組織的基因表達(dá)譜；結(jié)合乳腺癌和正常乳腺組織的差異性的熱點(diǎn)甲基化基因，采用

6、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法對熱點(diǎn)的基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　4.通過選擇乳腺癌和正常乳腺組織熱點(diǎn)的差異性甲基化基因，聯(lián)合分析DNA甲基化及其基因表達(dá)的情況，初步探討DNA甲基化對基因表達(dá)的影響及相互關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.乳腺癌和正常乳腺組織差異性的DNA甲基化表達(dá)譜
　　本研究選擇探針信號(hào)強(qiáng)度>40

7、0，乳腺癌與正常組織的MIRA/Input信號(hào)比大于1.2（p<0.01）的探針為陽性，至少2個(gè)探針陽性的基因定義為高甲基化基因。研究結(jié)果篩選出70個(gè)高甲基化，其中甲基化程度最高的5個(gè)基因分別是CCND2、PAX6、MNX1、OTX2、PITX2，另外ITGA4、NFIX、OTX2和FGF12首次被報(bào)道在乳腺癌組織中異常甲基化。這些差異甲基化基因所涉及的細(xì)胞功能主要為細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞損傷和修護(hù)、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄以及信

8、號(hào)通道等。
　　2.熱點(diǎn)的甲基化基因的驗(yàn)證
　　為了驗(yàn)證MIRA芯片分析結(jié)果的可信度，本研究選擇部分熱點(diǎn)基因在獨(dú)立的5例乳腺癌和正常乳腺標(biāo)本組織進(jìn)行驗(yàn)證。通過直接亞硫酸鹽測序法，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中WT1、PAX6和ITGA4基因的內(nèi)部，OTX2基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在分布廣泛的甲基化；在乳腺正常組織中同樣發(fā)現(xiàn)了WT1、OTX2基因的甲基化，但PAX6和ITGA4基因并未發(fā)現(xiàn)甲基化。采用COBRA方法檢測乳腺癌和乳腺正常組織腺標(biāo)本中

9、WT1、OTX2、PAX6和ITGA4的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示，在乳腺癌組織中WT1、OTX2和PAX6基因存在明顯高甲基化。直接亞硫酸鹽測序法和COBRA的結(jié)果都驗(yàn)證了DNA甲基化的MIRA芯片分析法的可靠性。
　　3. DNA甲基化與基因表達(dá)的相互關(guān)系
　　全基因組表達(dá)譜芯片分析顯示，10例乳腺癌和正常組織之間存在顯著性表達(dá)差異的基因共有1308個(gè)。結(jié)合乳腺癌和正常組織差異性的DNA甲基化譜，基因表達(dá)芯片檢測結(jié)果顯示一些高

10、甲基化基因的mRNA表達(dá)極低，在乳腺癌組織和正常組織中均無表達(dá)。而運(yùn)用RT-PCR對熱點(diǎn)基因進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果顯示：WTI和PITX2基因在乳腺癌組織中呈弱表達(dá)，在乳腺正常組織中不表達(dá)；而 OTX2和PAX6基因無論在乳腺癌組織或乳腺正常組織中均不表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.乳腺癌和正常乳腺組織間存在差異的DNA甲基化譜，提示DNA甲基化可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。
　　2. ITGA4，NFIX，OTX2和F