FEZ1-LZTS1基因在乳腺癌中的表達及啟動子區(qū)域甲基化的研究.pdf

1、乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈持續(xù)和明顯上升的趨勢?，F(xiàn)已公認腫瘤是一種基因病，研究與惡性腫瘤相關(guān)的關(guān)鍵基因，不僅可以更加清楚的了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制，而且為最終攻克癌癥奠定堅實的理論基礎(chǔ)。 FEZ1/LZTS1基因是1999年Ishii等在8p22克隆出的一個新的抑癌基因。FEZ1/LZTS1基因在許多正常組織中普遍表達，但多項研究表明該基因在50％以上的腫瘤細胞中有改變，說明FEZ1/LZTS1基因可能在多種腫瘤的發(fā)生

2、發(fā)展中起作用，值得關(guān)注的是Ishii等曾報道FEZ1/LZTS1基因在15例乳腺癌細胞系及10例原發(fā)性乳腺癌中均不表達，說明該基因的改變與乳腺癌有更加重要的關(guān)系。但是作為抑癌基因的FEZ1/LZTS1基因的失活機制尚未闡明。傳統(tǒng)觀點認為抑癌基因的失活是由基因突變、染色體缺失而導致的，但是多項研究表明FEZ1/LZTS1基因在多種腫瘤中突變罕見，說明突變可能并不是FEZ1/LZTS1基因失活的主要機制。近年來作為表遺傳學最常見事件的DNA

3、異常甲基化已成為研究基因沉默的焦點。因此本研究從FEZ1/LZTS1基因及其蛋白在乳腺癌中的表達入手，深入闡述FEZ1/LZTS1基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，并對該基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)進行檢測。 第一部分 FEZ1/LZTS1基因mRNA在乳腺癌組織中的表達 材料和方法：新鮮凍存乳腺癌組織及每個病例相應(yīng)的癌旁正常組織各50例，分別提取癌組織和相應(yīng)正常組織總RNA，采用RT-PCR方法檢測FEZ1/LZTS1基因m

4、RNA的表達。 結(jié)果： 1.50 例乳腺癌組織中FEZ1/LZTS1基因mRNA表達缺失7例(14％)，表達下降23例(46％)，表達正常20例(40％)；而相應(yīng)50例正常乳腺組織FEZ1/LZTS1基因mRNA全部表達。乳腺癌組織與正常乳腺組織相比FEZ1/LZTS1基因mRNA的表達明顯下調(diào)，差異有顯著性(P=0.000)。 2．乳腺癌組織FEZ1/LZTS1基因mRNA表達的缺失/下降與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，

5、即FEZ1/LZTS1基因mRNA表達缺失/下降組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯高于FEZ1/LZTS1基因mRNA表達正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P=-0．032)。 小結(jié)： 1．FEZ1/LZTS1基因在原發(fā)性乳腺癌組織中明顯發(fā)生改變，說明FEZ1/LZTS1基因在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 2．FEZ1/LZTS1基因mRNA表達的缺失/下降可能促進乳腺癌細胞的浸潤轉(zhuǎn)移。 第二部分 Fez1/Lzts1 蛋白在乳

6、腺癌組織中的表達及其與FEZ1/LZTS1基因mRNA 表達的關(guān)系 實驗一：Fez1/Lzts1 蛋白在乳腺癌組織中的表達 材料和方法： 運用免疫組織化學法(SP法)對100例石蠟包埋乳腺癌標本Fez1/Lzts1蛋白的表達進行檢測。 結(jié)果： 1．Fez1/Lzts1蛋白在正常乳腺導管上皮中全部表達，蛋白定位于胞漿，呈棕黃色顆粒狀。 2．100例乳腺癌中，72例(72％)Fez1/Lzts

7、1蛋白表達缺失和/或下降；其中28例強陽性(+)，29例中度陽性(+/—)，29例弱陽性(—/+)，14例陰性(—)；88例浸潤性導管癌(IDC)中，65例(73.9％)Fez1/Lzts1蛋白表達缺失和/或下降，其中23例強陽性(+)、25例中度陽性(+/—)、26例弱陽性(—/+)及14例陰性(—)。 3．Fez1/Lzts1蛋白表達的缺失/下降與淋巴結(jié)□移顯著相□□◇<0.05)，尤其是Fez1/Lzts1蛋白表達陰□(—

8、)組及弱陽性(一/+)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯高于強陽性(+)及中度陽性(+/—)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 4．FEZ1/LZTS1基因mRNA 與 Fez1/Lzts1蛋白表達具有顯著的相關(guān)性(P=0.000)。 實驗二．FEZ1/LZTS1基因編碼區(qū)突變的檢測 材料和方法：新鮮凍存乳腺癌組織2例，提取癌組織DNA，采用 PCR-測序方法對FEZ1/LZTS1基因編碼區(qū)的突變進行檢測。 結(jié)果：

9、 在2例中均發(fā)現(xiàn)相同位點的3個點突變，分別為：1.第912位堿基G→A突變；2.第1516位堿基A→G突變；3．第1992位堿基T→C突變。第912位及第1992位堿基突變?yōu)闊o義突變；第1516位堿基突變導致第468位的氨基酸殘基天冬酰胺(N)轉(zhuǎn)變?yōu)樘扉T冬氨酸(D)。 小結(jié)： 1．Fez1/Lzts1 蛋白在原發(fā)性乳腺癌組織中明顯發(fā)生改變，這種改變可能主要發(fā)生在乳腺癌的進展期。 2．Fez1/Lzts1蛋白

10、表達的缺失/下降可能促進乳腺癌細胞的浸潤轉(zhuǎn)移，尤其是Fez1/Lzts1蛋白表達的細胞數(shù)小于50％時更有意義。 3．FEZ1/LZTS1基因mRNA 與 Fez1/Lzts1 蛋白表達顯著相關(guān)。 4．FEZ1/LZTS1 基因編碼區(qū)第1516位堿基A→G突變可導致氨基酸的改變，其意義有待于進一步研究。 第三部分乳腺癌細胞系中FEZ1/LZTS1 基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài) 材料和方法：提取11例乳腺癌細胞系

11、DNA，運用重亞硫酸鹽處理基因組DNA-PCR擴增-直接測序的方法對FEZ1/LZTS1 基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)進行檢測。 結(jié)果： 1例乳腺癌細胞系中10例(90.91％)發(fā)現(xiàn) FEZ1/LZTS1 基因啟動子區(qū)域存在甲基化。在一共28個可能發(fā)生甲基化的CpG島的5’胞嘧啶(C)位點，每個位點均至少在一個細胞系中發(fā)生了甲基化，甲基化頻率為0％～100％，平均甲基化頻率為65.26％。 小結(jié)： 乳腺癌細