殼聚糖-膠原-PEEK-HA支架負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究雙層殼聚糖-膠原/聚醚醚酮-羥基磷灰石支架的制作方法；支架負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，定向誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞表型，探討CS-COL/PEEK-HA支架作為軟骨組織工程支架的可行性。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定：無(wú)菌胸骨穿刺針從脛骨近段采取日本大耳白兔的骨髓約5ml，全骨髓培養(yǎng)法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells.BMSCs），10％胎牛血清的LG-DMEM作為細(xì)胞

2、培養(yǎng)基，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每周換液兩次。取第3代BMSCs，免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定其細(xì)胞表面抗原CD44、CD45，以用作對(duì)BMSCs的初步鑒定。
　　 2.殼聚糖-膠原/聚醚醚酮-羥基磷灰石支架制作：首先將PEEK和HA粉末按照70/30質(zhì)量比混勻，在激光選區(qū)燒結(jié)機(jī)上設(shè)計(jì)樣品直徑為5mm，厚度為3mm的圓柱形支架，通過(guò)設(shè)置燒結(jié)參數(shù)制作出PEEK-HA支架，將支架放入72孔板（模具）內(nèi)，取3％的殼聚

3、糖和2％的膠原混合的醋酸溶液傾注入模具中的PEEK-HA支架上，-20℃預(yù)冷凍10h，凍干機(jī)中冷凍抽干24h制作成雙層CS-COL/PEEK-HA復(fù)合支架，傅立葉紅外光譜、掃描電鏡、液體置換法測(cè)定其理化性質(zhì)。
　　 3.以BMSCs為種子細(xì)胞，以CS-COL/PEEK-HA為支架，構(gòu)建細(xì)胞/支架復(fù)合體。將細(xì)胞/支架共同培養(yǎng)48小時(shí)后，電鏡觀察細(xì)胞在支架上的分布、黏附及生長(zhǎng)情況。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組A（6例）和對(duì)照組B（6例），A組用含轉(zhuǎn)化

4、生長(zhǎng)因子-β1、地塞米松、維生素C和含有15％胎牛血清的HG-DMEM培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)，對(duì)照組用LG-DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。2周后觀察實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞成軟骨細(xì)胞表型和對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行免疫組織化學(xué)及生物學(xué)的相關(guān)檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定：細(xì)胞在10-14天呈克隆樣生長(zhǎng)，細(xì)胞呈紡錘狀、成纖維樣。14天后取第3代細(xì)胞作CD44免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)可見陽(yáng)性細(xì)胞主要集中在細(xì)胞密度高的區(qū)域，胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒，

5、細(xì)胞周圍也出現(xiàn)黃染區(qū)，CD45檢測(cè)結(jié)果為陰性。
　　 2.CS-COL/PEEK-HA支架的理化性質(zhì)：CS-COL軟骨層樣支架孔徑為160-380 μ m，平均為270 μ m左右，孔相通性好，支架孔隙率為（76±5.01％）。PEEK-HA支架孔徑為100-300μ m，平均為200 μ m左右，孔相通性好，支架孔隙率為（65±4.18％）。傅立葉紅外光譜儀測(cè)定的數(shù)據(jù)表明復(fù)合支架組成物有典型的殼聚糖、膠原峰，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有聚乙二醇

6、峰。軟骨下骨層樣支架組成物有典型的PEEK、HA峰。
　　 3.電鏡觀察和免疫組織化學(xué)檢測(cè)：
　　 BMSCs與CS-COL/PEEK-HA支架共培養(yǎng)48小時(shí)后可見多孔支架表面密布細(xì)胞，部分細(xì)胞己滲入支架孔內(nèi)呈簇生長(zhǎng)，底層細(xì)胞已呈梭形黏附在支架上，生長(zhǎng)較好。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)定向誘導(dǎo)2周后可見細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形向多邊形、多角形、不規(guī)則形轉(zhuǎn)化，細(xì)胞體積增大變?yōu)闄E圓形、圓形，此時(shí)細(xì)胞胞漿豐富，并分泌大量基質(zhì)，部分細(xì)胞出現(xiàn)突起向外伸展黏附