Gal-HSA-5-Fu的合成、肝靶向作用及抗癌活性初探.pdf

1、肝臟疾病嚴(yán)重危害人們的身體健康，尤其是肝炎和肝癌，是目前需要重點防治的重大疾病。這類疾病之所以難以根治，除了治療藥物本身的藥理作用不夠理想外，另一個重要因素是沒有將藥物有效地輸送至肝臟的病變部位，即藥物的肝靶向性差。肝靶向給藥系統(tǒng)能將藥物定向輸送到肝臟，減少其全身分布，減少藥物給藥劑量和次數(shù)，提高藥物的治療指數(shù)，降低其不良反應(yīng)，對肝臟疾病的治療有積極的推動作用。 目前，主要有如下二個途徑實現(xiàn)主動肝靶向藥物的傳輸：一是肝實質(zhì)細(xì)胞膜

2、上存在的無唾液酸糖蛋白受體；二是肝非實質(zhì)細(xì)胞膜上存在的甘露糖受體、低密度脂蛋白受體等。針對上述不同受體對藥物或載體進行修飾，通過受體-配體的特異相互作用可以實現(xiàn)藥物的肝細(xì)胞靶向。 有人比較了幾種肝靶向藥物模型的途徑，認(rèn)為經(jīng)無唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein Receptor，ASGP-R)介導(dǎo)途徑效果最好。該系統(tǒng)對肝有較高的親和性，肝吸收迅速，利用半乳糖?；拇蠓肿虞d體可以模擬去唾液酸糖蛋白，達到肝靶向目的

3、。目前以ASGP-R為靶點的肝靶向藥物已引起人們的極大關(guān)注。 5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)是一種嘧啶拮抗藥，在臨床上較早應(yīng)用于腫瘤的治療。它進入體內(nèi)后，能在分子水平上代替正常代謝物，摻入生物大分子，干擾DNA的合成，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，產(chǎn)生“無胸腺嘧啶死亡”。5-FU是細(xì)胞周期特異性藥物，對S期細(xì)胞作用較強。主要應(yīng)用于消化道腫瘤如胃腸癌、肝癌和頭頸部腫瘤的治療。然而，5-FU對癌細(xì)胞選擇性低，呈現(xiàn)較高的毒副

4、作用，如骨髓抑制、對神經(jīng)系統(tǒng)和消化道的損害等，影響了5-FU的臨床應(yīng)用。5-FU如能研制成肝靶向藥物，預(yù)期能充分發(fā)揮5-FU的抗肝癌作用，減少全身的毒副作用。 本文利用ASGP-R的肝靶向介導(dǎo)作用，設(shè)計并合成了肝靶向藥物半乳糖化人血清白蛋白與5-FU的偶合物，并探討了該偶合物的質(zhì)量分析、肝靶向作用和抗腫瘤活性作用。 在肝靶向藥物合成方面，本文設(shè)計并合成了帶一個半乳糖殘基、二個半乳糖殘基、三個半乳糖殘基的功能偶聯(lián)試劑，并將

5、帶一個半乳糖殘基的功能試劑(2-亞氨基-2-甲氧基乙基-1-硫代-B-D-半乳吡喃糖苷)IME-半乳吡喃糖苷與人血清白蛋白偶聯(lián)，合成了血批次的肝靶向藥物載體半乳糖化人血清白蛋白(galactosyl human serum albumin，Gal-HSA)。合成的Gal-HSA有較高的純度，不同批次的糖密度穩(wěn)定在48～52之間。將該藥物載體與5-FU偶合，得到了半乳糖化人血清白蛋白與5-FU的偶合物(galactosyl human s

6、erum albumincon3iugated with 5-Fu，Gal-HSA-5-FU)，偶合物中5-Fu的密度(每分子人血清白蛋白連接5-FU的分子數(shù))為15。 生物質(zhì)譜技術(shù)在生物大分子的分析中發(fā)揮著重要的作用。本文利用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)分析了合成的半乳糖化人血清白蛋白。結(jié)果表明，該技術(shù)用于半乳糖化人血清白蛋白與5-FU偶合物的分析，可以同時解決半乳糖、藥物與人血清白蛋白的結(jié)合狀

7、態(tài)、糖密度、藥密度和純度的分析問題，與差熱分析、SDS-PAGE電泳、Folins酚試劑法及苯酚硫酸法等分析方法相比，具有簡便、準(zhǔn)確和分析速度快的特點。 化學(xué)電離質(zhì)譜技術(shù)，一般只能獲得分子量信息。本文在應(yīng)用化學(xué)電離質(zhì)譜技術(shù)分析合成中間體的過程中，通過采用適當(dāng)?shù)碾婋x條件，獲得了既保留化合物準(zhǔn)分子離子峰，同時又有準(zhǔn)分子離子進一步碎裂產(chǎn)生的碎片離子峰，類似于二級質(zhì)譜的譜圖。這種電離方法的建立，使化學(xué)電離質(zhì)譜技術(shù)既可以獲得化合物的分子量

8、信息，同時也可以獲得化合物的結(jié)構(gòu)信息。該方法獲得的譜圖有較好的重現(xiàn)性，產(chǎn)生的碎片離子可用有機質(zhì)譜理論得到合理的解釋。本文利用該技術(shù)分析了合成的部分中間體，并對譜圖中碎片離子的可能產(chǎn)生途徑作了分析。 藥物體內(nèi)分布評價的常用手段有放射性同位素示蹤技術(shù)和色譜技術(shù)，兩種方法各有長處。本實驗同時利用同位素示蹤技術(shù)和HPLC方法監(jiān)測Gal-HSA-5-Fu的肝靶向作用，較全面和準(zhǔn)確地反映了Gal-HSA-5-Fu在體內(nèi)的分布情況。本文合成的

9、目標(biāo)產(chǎn)物半乳糖化人血清白蛋白5-FU偶合物，用<'131>I標(biāo)記后進行同位素示蹤實驗，經(jīng)家兔顯像和小鼠體內(nèi)分布實驗表明，標(biāo)記的偶聯(lián)物靜注后8分鐘，大部分濃聚于肝臟，肝攝取率達75.0％；HPLC的分析數(shù)據(jù)顯示，5-FU滯留在肝臟的濃度，從5分鐘至6小時均維持在一個高的水平。這一實驗結(jié)果說明：本文合成的GaI-HSA-5-FU具有明顯的肝靶向作用，達到了增加肝臟藥物濃度，提高療效并減少全身毒副作用的目的。 Gal-HSA-5-FU

10、偶合物是5-FU通過橋試劑與半乳糖化的人血清白蛋白偶聯(lián)而成，5-FU與半乳糖人血清白蛋白偶聯(lián)后，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，這種改變對抗腫瘤活性會發(fā)生何種影響，尚有待驗證。本實驗利用MTT法，研究Gal-HSA-5-FU對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的抑制作用，并用流式細(xì)胞術(shù)研究了Gal-HSA-5-FU的抗腫瘤活性機理。結(jié)果表明，偶聯(lián)物中5-FU濃度為2～65mg／L的范圍內(nèi)(Gal-HSA-5-FU偶合物的濃度按5-FU的實際含量計算)，G