糖尿病腎小管間質(zhì)骨調(diào)素表達變化及氟伐他汀、反義寡核苷酸對其干預(yù)作用的研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，已成為終末期腎衰竭的最主要原因之一。腎小管間質(zhì)損傷同腎小球病變一樣，是糖尿病腎病的主要特征及導(dǎo)致腎功能喪失的重要因素。DN的發(fā)病機制復(fù)雜，是糖代謝紊亂、腎小球血流動力學異常、生長因子、細胞因子以及遺傳等多因素綜合作用的結(jié)果，其中，炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及其誘導(dǎo)的單核巨噬細胞浸潤是DN發(fā)病的重要機制之一。 骨調(diào)素(osteopontin，OPN)是腎間質(zhì)

2、巨噬細胞的主要趨化因子，具有多項功能，作為一種巨噬細胞趨化因子可以募集巨噬細胞，介導(dǎo)巨噬細胞等炎癥細胞局部浸潤，同時作為一種生長因子可以刺激細胞增殖和膠原合成。研究表明，多種腎臟疾病模型中腎小管OPN表達上調(diào)，與間質(zhì)炎細胞浸潤和隨后的間質(zhì)纖維化改變密切相關(guān)，其在糖尿病腎小管間質(zhì)病變中也可能發(fā)揮重要作用。已有研究顯示，HMG-CoA還原酶抑制劑對糖尿病大鼠及糖尿病患者均具有一定的腎臟保護作用，不僅與降低膽固醇水平有關(guān)，還存在非降脂的抗增殖

3、、抗炎等作用，但其作用機制未完全闡明，是否與抑制腎臟OPN的表達有關(guān)，尚未見報道。 目的：本研究應(yīng)用實驗性糖尿病大鼠模型和高糖培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細胞，從整體、細胞、分子等不同水平，系統(tǒng)觀察糖尿病狀態(tài)下腎小管間質(zhì)OPN表達、巨噬細胞積聚、Ⅲ型膠原沉積等變化，及與糖尿病腎小管間質(zhì)病變發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系；另外應(yīng)用HMG-CoA還原酶抑制劑氟伐他汀(fluvastatin)及OPN反義寡核苷酸對糖尿病大鼠模型和高糖培養(yǎng)的人近端腎小管上

4、皮細胞進行干預(yù)，探討其對糖尿病腎小管間質(zhì)OPN表達的影響及其對腎臟的保護作用，為闡明糖尿病腎病的發(fā)病機理及尋找防治措施提供實驗性理論依據(jù)。 1 糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)骨調(diào)素的表達變化 雄性SD大鼠48只，隨機分為A組(正常對照組)和B組(糖尿病組)。用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘發(fā)實驗性糖尿病模型。分別在成模后第2周、4周、6周收集標本，檢測腎功能指標、腎臟組織形態(tài)學改變、腎小管間質(zhì)OPN、ED-1

5、、Ⅲ型膠原的表達。與同期A組相比，2、4、6周B組大鼠血糖、C反應(yīng)蛋白、腎重/體重、尿NAG均有不同程度的升高。尿白蛋白排泄率6周時升高，與A組相比差異顯著(P<0.01)。B組大鼠腎小球系膜基質(zhì)增多，部分腎小管發(fā)生空泡變性，腎小球及腎小管基底膜增厚，間質(zhì)增寬，炎性細胞浸潤。免疫組化結(jié)果顯示，2、4、6周B組大鼠腎小管上皮細胞OPN表達上調(diào)，腎間質(zhì)ED-1陽性細胞數(shù)增多，均隨病程延長而逐漸加重，6周時B組大鼠Ⅲ型膠原的表達上調(diào)(P<0.

6、01)，并且各時間點OPN蛋白表達水平與ED-1陽性細胞呈明顯的正相關(guān)(P<0.01)。RT-PCR半定量結(jié)果顯示，各時間點B組大鼠腎臟OPN mRNA表達均較A組顯著增高(2周P<0.05，4、6周P<0.01)。 2 高糖環(huán)境中人近端腎小管上皮細胞骨調(diào)素的表達變化 人近端腎小管上皮細胞HK2，分為三組：正常糖對照組(5.5mmol/LD-葡萄糖，NG)、高糖組(25mmol/LD-葡萄糖，HG)及高滲組(19.5 m

7、mol/L甘露醇和5.5 mmol/LD-葡萄糖，MG)。分別于實驗6h，24h，48h以及72h，運用半定量PT-PCR方法檢測各組細胞OPN mRNA的表達；間接免疫熒光法，激光共聚焦顯微鏡下觀察OPN蛋白的表達；ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中Ⅲ型膠原含量。RT-PCR及免疫熒光結(jié)果顯示，HG組OPNmRNA表達在6h即出現(xiàn)升高，48h達高峰，并持續(xù)到72h(P<0.01)；HG組OPN’蛋白表達在6h、24h、48h、72h逐

8、漸升高，同時各時間點與NG組相比，差異顯著(P<0.01)。高滲組各時間點OPN mRNA及蛋白表達沒有明顯變化，與NG組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。EIASA結(jié)果顯示HG組細胞培養(yǎng)上清液Ⅲ型膠原的含量在6h與NG組比較無明顯差異(p>0.05)，24、48h時其含量較NG組增高，72h時增高更為明顯(P<0.01)。高滲組細胞培養(yǎng)上清中Ⅲ型膠原含量沒有明顯變化，各時間點與NG組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 3

9、反義寡核苷酸對高糖環(huán)境中人近端腎小管上皮細胞骨調(diào)素表達的影響 針對人OPN的cDNA.序列設(shè)計合成反義寡核苷酸(AS-ODN)，以正義寡核苷酸(S-ODN)及錯義寡核苷酸(MS-ODN)為對照，所有堿基均經(jīng)硫代修飾。細胞分為8組：①正常糖對照組；②高糖組；③高糖+AS-ODN/DOTAP(2μmol/L)；④高糖+S-ODN/DOTAP(2μmol/L)；⑤高糖+MS-ODN/DOTAP(2μmol/L)；⑥高糖+AS-ODN/

10、DOTAP(20μmol/L)：⑦高糖+S-ODN/DOTAP(20μmol/L)；⑧高糖+MS-ODN/DOTAP(20μmol/L)。用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將不同濃度的OPN反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染人近端腎小管上皮細胞，熒光顯微鏡下觀察各組細胞轉(zhuǎn)染效率。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測OPNmRNA表達；間接免疫熒光法，激光共聚焦顯微鏡下觀察OPN蛋白的表達；ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清中Ⅲ型膠原分泌情況。2μmol/L及20μmo

11、l/L濃度OPN AS.ODN組OPNmRNA、蛋白表達及上清中Ⅲ型膠原含量均明顯低于高糖組(P<0.01)，并且20μmol/L組降低更明顯。而相同濃度和時間的S-ODN組和MS-ODN組與高糖組無顯著差異(P>0.05)。 4 氟伐他汀對糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)骨調(diào)素表達的影響 雄性SD大鼠隨機分為A組(正常對照組)、B組(糖尿病組)和C組(氟伐他汀治療組)。STZ誘導(dǎo)糖尿病模型。成模后，C組大鼠每日氟伐他汀按2mg

12、·kg<'-1>·d<'-1>灌胃。在6周后收集標本，檢測血糖、C反應(yīng)蛋白、血脂、腎重／體重、尿白蛋白排泄率(UAER)，尿N-乙酰-B-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)；觀察大鼠腎臟組織形態(tài)學改變；‘免疫組織化學方法檢測腎小管間質(zhì)OPN、ED-1、Ⅲ型膠原的表達；Western Blotting方法檢測腎組織中OPN蛋白的表達；RT-PCR方法檢測腎組織OPN mRNA表達。B組大鼠血糖、C反應(yīng)蛋白、血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、腎

13、重/體重、UAER，尿NAG均高于A組(P<0.01)，C組血糖與B組相比無明顯差異(P>0.05)，TG降低不明顯，其余上述指標均較B組降低。光鏡下B組大鼠腎小球系膜基質(zhì)增多，腎小管空泡變性，腎小球及腎小管基底膜增厚，間質(zhì)增寬，纖維組織增生，電鏡下腎小球臟層上皮細胞足突融合，內(nèi)皮細胞部分窗孔結(jié)構(gòu)消失，腎小管上皮細胞線粒體腫脹甚至空泡化，腎小管基底膜增厚。C組腎臟病理改變較B組均明顯減輕。免疫組化結(jié)果顯示，B組大鼠腎小管間質(zhì)OPN、 E

14、D-1、Ⅲ型膠原的表達均上調(diào)，與A組比較，差異顯著(P<0.01)，C組大鼠OPN、ED-1和Ⅲ型膠原的表達受到抑制(P<0.01、)。Western Blotting結(jié)果顯示，B組腎組織OPN蛋白表達明顯高于A組(P<0.01)，C組明顯低于B組(P<0.01)。RT-PCR半定量結(jié)果顯示，B組OPN mRNA表達較A組顯著增高(P<0.01)，C組的表達較B組明顯降低(P<0.01)。 5 氟伐他汀對高糖環(huán)境中人近端腎小管上

15、皮細胞骨調(diào)素表達的影響 結(jié)論：1、無論糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)，還是高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細胞OPN的表達均增高，提示OPN過表達可能參與了糖尿病腎小管間質(zhì)損害的發(fā)展過程。糖尿病狀態(tài)下，腎間質(zhì)單核巨噬細胞浸潤，細胞外基質(zhì)進行性積聚等腎臟病理改變可能與OPN表達異常有關(guān)。2、OPN’反義寡核苷酸能夠特異性地抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細胞OPNmRNA及蛋白表達，進而抑制Ⅲ型膠原分泌，表明OPN可能在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞膠