肛門直腸畸形泄殖腔凋亡及腸管Cajal間質(zhì)細(xì)胞的研究.pdf

1、本文擬通過(guò)乙烯硫脲致畸動(dòng)物模型研究胚胎末期ARM整個(gè)腸管ICC的發(fā)育情況并進(jìn)一步利用ARM患者直腸末端標(biāo)本來(lái)研究直腸末端ICC的表達(dá)情況，為ARM術(shù)后便秘的診斷、治療提供一些理論依據(jù)。 研究方法： 1、利用TUNEL染色技術(shù)檢測(cè)正常胎鼠、泄殖腔畸形胎鼠胚胎13天-16天泄殖腔凋亡細(xì)胞的動(dòng)態(tài)分布情況。 2、利用SABC染色方法研究正常胎鼠、泄殖腔畸形胎鼠胚胎13天-16天泄殖腔bcl-2，bax基因的表達(dá)情況。

2、 3、利用SABC染色方法檢測(cè)胚胎21天正常胎鼠、ARM胎鼠小腸、結(jié)腸和直腸ICC的發(fā)育情況。 4、利用RT-PCR方法研究28例ARM患者直腸末端c-kit基因和SCF基因的表達(dá)情況。 研究結(jié)果： 1、肛門直腸畸形泄殖腔凋亡細(xì)胞的動(dòng)態(tài)分布情況： 正常胎鼠胚胎13天生殖結(jié)節(jié)已形成，泄殖腔的輪廓清晰，在泌尿生殖竇和直腸間可見尿直腸隔，尾溝已形成。尿直腸隔上皮層和間質(zhì)區(qū)域可見凋亡細(xì)胞。隨著胚胎發(fā)育，生殖結(jié)

3、節(jié)逐漸向腹尾側(cè)延伸，尿直腸隔逐漸向下延伸并向腹尾側(cè)遷移，尾溝逐漸加深，泄殖腔膜向背尾側(cè)旋轉(zhuǎn)。尿直腸隔間質(zhì)的凋亡細(xì)胞逐漸增多并向下延伸，腹側(cè)間質(zhì)比背側(cè)間質(zhì)凋亡細(xì)胞明顯；直腸背側(cè)間質(zhì)可見大量凋亡細(xì)胞。胚胎14天，直腸末端和未來(lái)肛門開口處的泄殖腔膜開始出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，此期為細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用的關(guān)鍵時(shí)期。胚胎15天，尿直腸隔與泄殖腔膜融合，尿直腸隔間質(zhì)內(nèi)的凋亡細(xì)胞一直向下延伸到融合部位。胚胎16天，肛膜裂解，直腸與外界相通。 泄殖腔發(fā)育畸形

4、胎鼠與正常胎鼠相比，生殖結(jié)節(jié)的發(fā)育、尿直腸隔的下降和泄殖腔構(gòu)型的變化均不同程度的延遲。尿直腸隔間質(zhì)、直腸背側(cè)間質(zhì)和泄殖腔膜的凋亡細(xì)胞均明顯減少。胚胎15天，尿直腸隔未與泄殖腔膜融合，直腸末端與泄殖腔膜的距離仍較遠(yuǎn)。胚胎16天，肛膜未裂解，產(chǎn)生不同類型的ARM畸形。 2、肛門直腸畸形泄殖腔bcl-2，baX基因的表達(dá)情況： 正常胎鼠胚胎13天尿直腸隔上皮層bax抗體染色陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的80％以上；尿直腸隔間質(zhì)染色陽(yáng)性細(xì)

5、胞很少，不超過(guò)總數(shù)的10％。隨著胚胎發(fā)育，上皮層陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少；而間質(zhì)，胚胎14天陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，在未來(lái)肛門開口的泄殖腔膜上皮層可見陽(yáng)性細(xì)胞。胚胎15、16天間質(zhì)內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞較少。與正常胎鼠相比，泄殖腔畸形胎鼠胚胎13.5天、14天上皮層和間質(zhì)區(qū)域bax抗體陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。 正常胎鼠bcl-2抗體染色陽(yáng)性細(xì)胞在尿直腸隔上皮層胚胎13天最明顯，后逐漸減少。而在尿直腸隔間質(zhì)區(qū)域陽(yáng)性細(xì)胞不超過(guò)10％，各期無(wú)明顯變化。與正常胎鼠相

6、比，泄殖腔畸形胎鼠胚胎13.5天尿直腸隔上皮層和間質(zhì)區(qū)域bcl-2抗體陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增加。 3、肛門直腸畸形腸管Cajal間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)情況： 小腸、結(jié)腸和直腸c-kit抗體陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于肌間神經(jīng)叢，肌間可見少量陽(yáng)性細(xì)胞。 正常胎鼠，胚胎21天小腸、結(jié)腸和直腸80％以上的肌間神經(jīng)叢周圍可見大量c-kit抗體陽(yáng)性細(xì)胞；ARM畸形胎鼠除小腸80％以上肌間神經(jīng)叢周圍有大量陽(yáng)性細(xì)胞外，結(jié)腸和直腸陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，僅

7、50％或50％以下的肌間神經(jīng)叢周圍有陽(yáng)性細(xì)胞。 4、肛門直腸畸形直腸末端c-kit和SCF的表達(dá)情況： c-kit mRNA的表達(dá)在正常對(duì)照組、高位ARM組、中位．ARM組、低位ARM組、后天性肛瘺組分別為1.79±0.22、0.67±0.19、0.89±0.17、1.57±0.25、1.68±0.18。與正常對(duì)照組相比較，高位ARM組、中位ARM組有意義(P<0.05)；后天性肛瘺組、低位ARM組無(wú)意義(P>0.05)

8、。 SCF mRNA的表達(dá)在正常對(duì)照組、高位ARM組、中位ARM組、低位ARM組、后天性肛瘺組分別為1.72±0.19、0.65+0.16、0.98+0.19、1.61±0.24、1.69±0.14。與正常對(duì)照組相比較，高位、中位ARM組有意義(P<0.05)；后天性肛瘺組、低位ARM組無(wú)意義(P>0.05)。 研究結(jié)論： 1、在肛門直腸的胚胎發(fā)育過(guò)程中，尿直腸隔的下降、融合過(guò)程、泄殖腔的構(gòu)型變化和肛膜的裂解均與

9、細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。泄殖腔畸形胎鼠尿直腸隔間質(zhì)、直腸背側(cè)間質(zhì)和泄殖腔膜的凋亡細(xì)胞明顯減少，阻礙了泄殖腔的正常胚胎發(fā)育過(guò)程，可能是導(dǎo)致ARM產(chǎn)生的重要機(jī)制之一。 2、在泄殖腔發(fā)育過(guò)程中，尿直腸隔上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)bcl-2、bax基因。并且這兩種基因相互作用共同調(diào)節(jié)泄殖腔細(xì)胞的凋亡，保證泄殖腔的正常發(fā)育。而肛門直腸畸形胎鼠尿直腸隔上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞bcl-2、bax基因表達(dá)異常，導(dǎo)致泄殖腔細(xì)胞凋亡的異常，是產(chǎn)生ARM畸形的原因之