Toll樣受體-9通路增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞抗凋亡及侵襲、轉(zhuǎn)移能力的研究.pdf

1、越來(lái)越多的流行病學(xué)及實(shí)驗(yàn)室研究均發(fā)現(xiàn)慢性炎癥促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。體內(nèi)免疫細(xì)胞通過(guò)Toll樣受體對(duì)消滅病原體、清除炎癥發(fā)揮重要作用。Toll樣蛋白受體在免疫細(xì)胞上廣泛表達(dá)，它可識(shí)別微生物體內(nèi)的天然配體(如細(xì)菌或病毒DNA等)，然后激發(fā)免疫及炎癥反應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)TLRs在腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)，然而，在水火不相容的免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，其真正的意義仍不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TLR9表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞中，TLR9特異性激動(dòng)劑可以

2、增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞對(duì)抗TRAIL所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的耐受能力；也可以上調(diào)細(xì)胞因子COX—2、IL—8、TGF—β1的表達(dá)及分泌。不僅如此，結(jié)果提示TLR9激動(dòng)劑還可以激活NF—KB，且NF—KB的激活是COX—2、IL—8、TGF—β1的表達(dá)上調(diào)所必須的，也是CpG—ODN誘導(dǎo)的細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)所必須的。 接著，選取TLR9下游細(xì)胞因子之一COX—2在組織標(biāo)本中進(jìn)行研究，我們應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)了58例前列腺癌組織中COX—2及V

3、EGF—C的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COX—2與VEGF—C兩者的表達(dá)密切相關(guān)，且這兩個(gè)蛋白的表達(dá)均與腫瘤淋巴管形成、淋巴管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)的關(guān)系。這一結(jié)果提示在前列腺癌中，COX—2也許是通過(guò)上調(diào)VEGF—C的表達(dá)而促進(jìn)淋巴管形成、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的。 因此，本研究顯示TLR9在前列腺癌細(xì)胞上存在功能性的表達(dá)，它可以通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗凋亡、上調(diào)細(xì)胞因子的表達(dá)、誘導(dǎo)腫瘤新生淋巴管形成、促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等最終加速腫瘤的惡性進(jìn)程。

4、 本研究包括3個(gè)部分：第一部分，前列腺癌PC—3細(xì)胞在TLR9的激動(dòng)劑CpG—ODN作用下，細(xì)胞對(duì)抗TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的耐受能力明顯增強(qiáng)，而且這一現(xiàn)象能被TLR9的抑制劑chloroquine及NF—ΚB的特異性阻斷劑PDTC所減弱，提示TLR9通路通過(guò)激活NF—ΚB實(shí)現(xiàn)細(xì)胞抗凋亡能力的增強(qiáng)。第二部分，CpG通過(guò)TLR9通路上調(diào)細(xì)胞因子COX—2、IL—8、TGF—β1的表達(dá)，而且這一作用能被NF—ΚB的特異性阻斷劑PDT

5、C消除，提示CpG—ODN通過(guò)激活NF—ΚB而上調(diào)COX—2、IL—8、TGF—β1的表達(dá)。第三部分，為了更好地了解TLR9對(duì)前列腺癌轉(zhuǎn)移的作用，我們選擇了一種TLR9下游的細(xì)胞因子COX—2在前列腺癌組織標(biāo)本上做后繼研究，我們發(fā)現(xiàn)，COX—2和VEGF—C的表達(dá)密切相關(guān)，而這兩者均與腫瘤新生淋巴管形成、淋巴管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)的關(guān)系，提示COX—2也許是通過(guò)上調(diào)VEGF—C的表達(dá)而最終促進(jìn)前列腺癌發(fā)生侵犯、轉(zhuǎn)移，加速腫瘤的惡性進(jìn)

6、程。 第一部分Toll樣受體9通路體外增強(qiáng)前列腺癌PC—3細(xì)胞抗凋亡能力的研究 目的：大量的研究結(jié)果顯示慢性炎癥可以加速腫瘤的惡性進(jìn)程，在這一過(guò)程中TLRs可能起了重要的作用。本研究目的是了解CpG—ODN是否能夠通過(guò)TLR9信號(hào)途徑增強(qiáng)前列腺癌PC—3細(xì)胞的抗凋亡能力。 方法：應(yīng)用RT—PCR、流式細(xì)胞術(shù)、及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了前列腺癌細(xì)胞上TLRs包括TLR9的表達(dá)情況，以及應(yīng)用CpG刺激前后細(xì)胞對(duì)抗TRAIL

7、誘導(dǎo)的凋亡耐受能力，同時(shí)檢測(cè)了NF—ΚB激活情況以及其在細(xì)胞抗凋亡能力提高的過(guò)程中的所起的作用。 結(jié)果：TLR9激動(dòng)劑CpG—ODN能夠激活NF—ΚB使其進(jìn)行核轉(zhuǎn)位、增強(qiáng)PC—3細(xì)胞對(duì)抗TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的耐受能力。PC—3細(xì)胞NF—ΚB的激活及抗凋亡能力的增強(qiáng)均能夠被TLR9抑制劑chloroquine所減弱，提示這一過(guò)程通過(guò)TLR9通路發(fā)揮作用；同時(shí)，NF—ΚB的特異性阻斷劑PDTC也能明顯削弱PC—3細(xì)胞抗凋亡能力的

8、增強(qiáng)。 結(jié)論：TLR9激動(dòng)劑CpG—ODN能夠增強(qiáng)PC—3細(xì)胞對(duì)抗TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的耐受能力，該過(guò)程至少部分通過(guò)了NF—KB的激活來(lái)完成的，這個(gè)結(jié)果提示：慢性炎癥可以通過(guò)TLR9信號(hào)通路加速腫瘤的惡性進(jìn)程。 第二部分TLR9激動(dòng)劑通過(guò)激活NF—κB上調(diào)細(xì)胞因子COX—2、IL—8、TGF—β1的表達(dá) 目的：最近的研究顯示CpG—ODN在體外可通過(guò)Toll樣受體9(TLR9)通路增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能

9、力。由于環(huán)氧合酶—2(COX—2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β1(TGF—β1)及白介素—8(IL—8)在多種腫瘤包括前列腺癌中呈過(guò)表達(dá)，是腫瘤進(jìn)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的重要促進(jìn)因子。本實(shí)驗(yàn)旨在探討在前列腺癌中TLR9通路激活是否可以上調(diào)COX—2，TGF—β1及IL—8的表達(dá)。 方法：PC—3細(xì)胞經(jīng)CpG—ODN刺激后，通過(guò)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、半定量RT—PCR、ELISA、及westernbolt等手段，檢測(cè)了COX—2，TGF—β1，及IL—8

10、的表達(dá)情況，同時(shí)應(yīng)用免疫熒光染色檢測(cè)了核轉(zhuǎn)錄因子—κB(NF—κB)的激活，以及NF—κB的激活在COX—2，TGF—β1及IL—8的上調(diào)表達(dá)過(guò)程中的作用。 結(jié)果：CpG—ODN可以上調(diào)COX—2，TGF—β1，及IL—8的表達(dá)，并具有刺激的濃度、時(shí)間依賴性；同時(shí)，經(jīng)CpG—ODN刺激后，NF—κB被激活，P65轉(zhuǎn)移入核內(nèi)；NF—κB的激活在CpG—ODN上調(diào)COX—2，TGF—β1，及IL—8表達(dá)的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

11、 結(jié)論：前列腺癌細(xì)胞中TLR9通路的激活能夠上調(diào)COX—2，TGF—β1及IL—8的表達(dá)，該過(guò)程部分通過(guò)激活NF—κB而實(shí)現(xiàn)的，提示TLR9通路的激活也許可以通過(guò)這些途徑而增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。 第三部分COX—2通過(guò)上調(diào)VEGF—C的表達(dá)促進(jìn)前列腺癌新生淋巴管形成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 目的：大量的研究表明環(huán)氧合酶—2能夠促進(jìn)前列腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移，而且可以上調(diào)一些腫瘤組織中新生淋巴管形成及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)—C的表達(dá)。本研

12、究旨在探討在前列腺癌組織中COX—2能否上調(diào)VEGF—C的表達(dá)。 方法：通過(guò)應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)58例前列腺癌組織中COX—2、VEGF—C及D2-40的表達(dá)，并分析COX—2的表達(dá)與VEGF—C、微淋巴管密度、及臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。 結(jié)果：前列腺組織中COX—2與VEGF—C的表達(dá)有較強(qiáng)的相關(guān)性(r=0.631，p<0.001)，COX—2和VEGF—C的高表達(dá)與腫瘤淋巴管形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率(b—PF