GSTπ基因在宮頸癌中生物學(xué)作用的研究.pdf

1、目的：研究外源性Gstπ基因的高表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移、浸潤和輻射敏感性的影響，初步探討Gstπ基因的生物學(xué)功能及作用機(jī)制。 方法：(1)根據(jù)GeneBank中GSTπ的基因序列，自行設(shè)計(jì)擴(kuò)增Gstπ基因全長cDNA的引物，將人類全長GSTπ cDNA定向地克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3中，并采用限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA序列分析鑒定建立好的pcDNA3.0-GSTπ重組質(zhì)粒；(2)采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法，完

2、成pcDNA3/GSTπ載體和pcDNA3“空”載體(作為陰性對照)轉(zhuǎn)染，在含有G418的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)一步篩選陽性克隆。采用RT-PCR和Western Blot檢測克隆細(xì)胞中GSTπ mRNA和蛋白表達(dá)水平；(3)采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察GSTπ轉(zhuǎn)染后，對體外培養(yǎng)的宮頸癌HeLa細(xì)胞生長和增殖的影響；(4)劃痕實(shí)驗(yàn)和Boyden小室法用于觀察GSTπ轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞系HeLa轉(zhuǎn)移及侵襲能力的改變；(5)細(xì)胞接受不同劑量的χ射線照射后，應(yīng)用

3、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測GSTTπ對HeLa細(xì)胞輻射敏感性的影響；(6)采用流式細(xì)胞術(shù)分析GSTπ對HeLa細(xì)胞周期進(jìn)程的影響；Western Blot法檢測GSTπ對調(diào)控細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因或蛋白表達(dá)水平的影響。 結(jié)果：(1)經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列分析證實(shí)GSTπ真核表達(dá)載體構(gòu)建成功；(2)經(jīng)RT-PCR和Western Blot證實(shí)G418篩選得到的陽性克隆中GSTπ高表達(dá)，表明GSTπ高表達(dá)的細(xì)胞株篩選成功；(

4、3)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明GSTπ高表達(dá)可以明顯抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長和增殖；(4)劃痕實(shí)驗(yàn)和Boyden小室法結(jié)果顯示高水平GSTπ明顯降低宮頸癌HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力；(5)克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明GSTπ高水平表達(dá)可降低宮頸癌HeLa細(xì)胞對X射線的輻射敏感性；(6)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明GSTπ高表達(dá)可導(dǎo)致HeLa細(xì)胞在G0/G1期的阻滯。Western Blot法檢測出GSTπ明顯增加細(xì)胞周期G1期調(diào)控因子cyclin D1

5、和細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)抑制蛋白PTEN的表達(dá)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源性Gstπ基因轉(zhuǎn)染提高Gstπ表達(dá)水平可以抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長，其中的機(jī)制可能與其降低cyclin D1的蛋白表達(dá)，從而引發(fā)細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。GSTπ高水平表達(dá)還可明顯抑制HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，這可能與其上調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因PTEN的蛋白表達(dá)水平有關(guān)。此外，GSTπ高表達(dá)使HeLa細(xì)胞的輻射敏感性降低。其機(jī)制可能是通過調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclinB1