宮頸癌移植瘤的超聲造影及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的腫瘤，其發(fā)病率居惡性腫瘤之首，是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤死亡的主要原因之一，所以宮頸癌的早期診斷有著重要的意義。本實驗應(yīng)用瘤細(xì)胞懸液移植法，在具有正常免疫功能的大鼠體內(nèi)建立大鼠宮頸癌移植瘤動物模型，為宮頸腫瘤的早期診斷提供前期的動物實驗依據(jù)。探討大鼠宮頸癌移植腫瘤組織中的有絲分裂原激活蛋白激酶P38的表達(dá)及其臨床意義；研究P38的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。同時應(yīng)用新一代超聲造影劑聲諾維觀察造影對實驗兔肌肉內(nèi)人宮頸癌

2、移植腫瘤的血流灌注顯像的影響，評價聲諾維(SonoVue)在超聲顯像中的造影增強(qiáng)作用，探討及檢驗不同造影劑劑量在二次諧波顯像中對兔富頸癌移植瘤造影效果的影響與變化規(guī)律，為臨床腫瘤診斷和鑒別診斷提供依據(jù)。 方法： 第一部分： 體外培養(yǎng)HELA細(xì)胞，采用細(xì)胞記數(shù)法觀察細(xì)胞生長情況。將對數(shù)生長期的HELA按2.5×107、2.5×106、2.5×105分別接種于大鼠的背部皮下、腹腔內(nèi)、靜脈注射，建立宮頸癌移植瘤動物模型

3、，并于接種后觀察成瘤率、腫瘤生長及播散情況及動物生存期，于種植后第7D、10D、14D、17D、21D行超聲檢查，然后等到實驗鼠自然死亡，并對腫瘤進(jìn)行病理學(xué)檢查，確定腫瘤的存在及性質(zhì)。 第二部分： 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和Western-blot方法檢測人宮頸癌鼠移植瘤及其癌旁正常組織中P38及磷酸化P38的蛋白表達(dá)情況。 (一)免疫組化法 1.按照試劑盒說明書步驟抗p38免疫組化染色。切片常規(guī)脫蠟致水，高

4、溫高壓抗原修復(fù)，一抗4 ℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。PBS代替一抗作為陰性對照，用已知宮頸癌陽性片做陽性對照。 2.結(jié)果判定：在雙盲法下進(jìn)行，以腫瘤細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。每張切片在光、鏡下隨機(jī)選取5個視野，每個視野計數(shù)100個瘤細(xì)胞，著色強(qiáng)度分為無色(-)為0分，淺黃色(+)為1分，黃色及棕黃色(++)為2分；陽性細(xì)胞數(shù)<10％為0分，10％-50％為1分，>50％為2分。兩項得分相乘結(jié)果≥2記為陽性。

5、 (二)Western b1ot法 取-70°保存的移植瘤及癌旁正常組織約100mg加入預(yù)冷的蛋白裂解液，剪碎，勻漿超聲處理，高速低溫離心提取上清為細(xì)胞總蛋白。電泳(12％SDS-PAGE凝膠)、轉(zhuǎn)印，5％脫脂奶粉封閉液封閉1h，一抗4 ℃孵育過夜，與相應(yīng)二抗室溫下孵育2h，曝光，雙蒸水沖洗，干燥，避光保存，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀(chemi1mager 5500，Alpha Innotech，USA)采集，進(jìn)行灰度

6、值測定。 第三部分： 建立兔宮頸癌移植瘤模型十只。彩超每周觀察腫瘤生長情況，共10周，于1～4周測量血流動力學(xué)參數(shù)；同時，患有宮頸癌移植瘤的兔分別經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注法注射聲學(xué)造影劑0.2、0.4、0.6ml/kg，然后用二次諧波顯像觀察腫瘤造影效果；應(yīng)用彩色多普勒、能量多普勒觀察兔肌肉層內(nèi)移植瘤血流灌注情況并定量分析。 結(jié)果： 第一部分： 在體外培養(yǎng)條件下的HELA細(xì)胞生長迅速，將不同數(shù)量的HELA細(xì)

7、胞接種大鼠不同部位后，成瘤率為67％，迅速發(fā)生腹腔播散并產(chǎn)生大量腹水，其生物學(xué)行為與人宮頸腫瘤相似。腫瘤細(xì)胞負(fù)荷增加，動物生存期明顯縮短(p<0.01)。三組模型的組織病理學(xué)檢查無明顯差別。腫瘤的內(nèi)部回聲可分為高回聲、等回聲、低回聲三類，隨著腫瘤的生長其回聲類型有所轉(zhuǎn)變；鼠的人宮頸癌移植瘤的生長狀況、回聲類型及血供變化的動態(tài)演化大體符合宮頸癌的一般超聲表現(xiàn)特點。該種植瘤的增長是進(jìn)行性的，超聲征象隨腫瘤的進(jìn)展而逐步體現(xiàn)，基本符合腫瘤侵襲的

8、定義特征，該動物模型可用于超聲對宮頸癌惡性生物學(xué)行為的觀察。 第二部分： P38在宮頸癌移植瘤組織中的表達(dá)陽性率為95.5％，在癌旁正常組織中的表達(dá)為33.1％。P38在宮頸癌移植瘤中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。P38的表達(dá)定位于胞質(zhì)中，胞核中無表達(dá)；P38的表達(dá)與病程、腫瘤大小、腫瘤位置無明顯相關(guān)。P38的表達(dá)與組織分化程度及有無淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有顯著差異(P<0.01)。 第三部分

9、： 在兔的宮頸癌移植瘤模型中：PDI可探及星點狀、短棒狀和條狀血流，各時期RI和PI值無顯著性差異。造影后增強(qiáng)了肌肉內(nèi)移植瘤的血管顯示率及血流信號強(qiáng)度，腫瘤造影表現(xiàn)為快速增強(qiáng)，緩慢減退，持續(xù)時間較長的特點；新型聲學(xué)造影方法可以明顯增強(qiáng)腫瘤的二維超聲影像。 結(jié)論： 在具有正常免疫功能的大鼠體內(nèi)成功建立的宮頸癌移植瘤模型能較好地模擬人自發(fā)宮頸癌的生物學(xué)特征，有助于了解宮頸癌生物學(xué)及免疫學(xué)特性，可作為良好的腫瘤模型用于

10、宮頸癌的免疫治療研究及進(jìn)行影像學(xué)的研究。該種植瘤超聲征象隨腫瘤的進(jìn)展而逐步體現(xiàn)，基本符合腫瘤侵襲的定義特征，該動物模型可用于超聲對宮頸惡性腫瘤生物學(xué)行為的觀察。本實驗雖然屬于臨床前期的動物研究，但腫瘤直徑基本≤3cm，其超聲常規(guī)指標(biāo)的動態(tài)觀測將有助于臨床早期宮頸腫瘤的診斷與鑒別。聲學(xué)造影提高了兔肌肉內(nèi)宮頸癌移植瘤血流灌注的顯示，增強(qiáng)其血流信號，造影顯像優(yōu)于彩色多普勒顯像。P38在宮頸腫瘤的細(xì)胞中呈高表達(dá)，并與病程進(jìn)展密切相關(guān)，與宮頸癌的