17q21區(qū)域發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位易感基因的定位、鑒定與初步功能研究.pdf

1、發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(Developmental dysplasia of the hip，DDH)是小兒骨科常見(jiàn)的先天畸形之一。發(fā)病率在不同的人群中有較大差異，在拉普人和美國(guó)土著人的發(fā)病率約為25～50‰，而非洲人群則明顯降低。在我國(guó)發(fā)病率約為1.1～3.8‰，北方略高些。DDH作為一種常見(jiàn)的危害出生人口健康的疾病，其病因不清，認(rèn)為是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。其中，遺傳因素發(fā)揮主要作用，但目前DDH的致病基因尚未明確定位。

2、 前期，本課題組應(yīng)用傳遞不平衡檢驗(yàn)(Transmission disequilibrium test，TDT)方法，發(fā)現(xiàn)染色體17q21區(qū)域的D17S1820位點(diǎn)與DDH有關(guān)聯(lián)，提示在該位點(diǎn)附近可能存在DDH的易感基因。因此，本研究中我們繼續(xù)在D17S1820附近選擇多個(gè)STR遺傳標(biāo)記，采用TDT方法，對(duì)DDH的易感區(qū)段進(jìn)行定位；并選擇該區(qū)域內(nèi)可能與DDH的發(fā)生相關(guān)的基因，進(jìn)行突變篩查及初步的功能研究，力爭(zhēng)在分子水平揭示DDH的發(fā)病

3、機(jī)制。 方法： 本研究所涉及的DDH核心家系及正常對(duì)照兒童的外周靜脈血均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒骨科。所有患兒均經(jīng)臨床及影像學(xué)確診，畸形性髖脫位、神經(jīng)源性髖脫位及綜合征性髖脫位被排除在外。所有外周血的留取均已征得家長(zhǎng)的同意，并告知用于科學(xué)研究的目的。本課題的研究已經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)道德倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。 一、17q21區(qū)域DDH易感基因的定位 根據(jù)等位基因的數(shù)目(≥5)、雜合度(≥0.

4、70)及多態(tài)信息含量(PIC≥0.5)，在D17S1820附近選擇了11個(gè)STR位點(diǎn)，采用PCR—毛細(xì)管電泳的方法，對(duì)103個(gè)DDH核心家系的309名成員進(jìn)行基因分型，并進(jìn)行TDT檢驗(yàn)。同時(shí)，在100名正常人中，對(duì)有意義的STR位點(diǎn)進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，計(jì)算其等位基因頻率、基因型頻率、雜合度的觀察值和期望值及多態(tài)信息含量，并進(jìn)行Hardy—weinberg平衡檢驗(yàn)。以評(píng)價(jià)所選用的STR位點(diǎn)在中國(guó)東北漢族人群中是否達(dá)到了遺傳平衡，為以后的疾

5、病關(guān)聯(lián)分析奠定基礎(chǔ)。 二、COL1A1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)突變篩查 選擇上述已定位的區(qū)域內(nèi)，可能與DDH的發(fā)生相關(guān)的COL1A1基因作為候選基因，對(duì)其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1060bp(—1024～+36bp)的片段設(shè)計(jì)4對(duì)引物，在109個(gè)DDH患兒中分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序。有基因變異的患兒，對(duì)其父母及100個(gè)正常兒的該段啟動(dòng)子也進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，以確定變異位點(diǎn)的性質(zhì)。 三、COL1A1基因啟動(dòng)子區(qū)突變對(duì)其表

6、達(dá)的影響 通過(guò)上述基因突變篩查，檢測(cè)到了COL1A1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)—106位堿基存在C→T雜合突變。為進(jìn)一步明確該突變?cè)贑OL1A1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平的作用，采用定點(diǎn)突變的方法，構(gòu)建了COL1A1基因啟動(dòng)子的野生型和突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，通過(guò)比較表達(dá)的熒光素酶活性，明確該突變?cè)谵D(zhuǎn)錄水平對(duì)COL1A1基因表達(dá)的影響。 1、PCR擴(kuò)增正常人COL1A1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游—1024～+36bp的啟動(dòng)子序

7、列，片段長(zhǎng)度為1060bp。 2、經(jīng)T/A克隆，連接酶切位點(diǎn)，再連接到PGL3—basic載體，得到野生型的PGL3—COL1A1表達(dá)載體。 3、再采用定點(diǎn)突變的方法，把—106位堿基的C突變成T，再連接到PGL3—basic載體，構(gòu)建突變型的PGL3—COL1A1表達(dá)載體。 4、用構(gòu)建好的兩種表達(dá)載體及PGL3—basic分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，測(cè)定各組細(xì)胞表達(dá)的熒光素酶的相對(duì)活性，以

8、明確COL1A1啟動(dòng)子區(qū)—106位堿基C→T突變對(duì)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。 結(jié)果： 一、17q21區(qū)域DDH易感基因的定位 (一)正常人群STR位點(diǎn)多態(tài)性分析 100名無(wú)血緣關(guān)系的個(gè)體中，在D17S810位點(diǎn)只檢測(cè)到兩個(gè)等位基因；在D17S931位點(diǎn)，雖然檢測(cè)到了7個(gè)等位基因和9種基因型，但其雜合度僅為41.13％，多態(tài)信息含量?jī)H為0.3816，這兩個(gè)位點(diǎn)不能提供足夠的多態(tài)信息。其余9個(gè)STR位點(diǎn)的多態(tài)信息含

9、量均在0.5以上，具有良好的多態(tài)性。同時(shí)，經(jīng)X2檢驗(yàn)，各位點(diǎn)均符合Hardy—Weinberg平衡定律，表明這些位點(diǎn)在我國(guó)東北漢族人群中達(dá)到了遺傳平衡。其中，多態(tài)性最好的是D17S806和D17S787兩個(gè)位點(diǎn)，在這兩個(gè)基因座分別檢測(cè)到18和10個(gè)等位基因，它們的期望雜合度分別為0.87和0.8038，PIC分別為0.8961和0.8189，具有極高的多態(tài)信息含量。因此，D17S806和D17S787這兩個(gè)基因座是在東北漢族人群中進(jìn)行疾

10、病的連鎖分析、基因定位等研究最理想的遺傳標(biāo)記。 (二)TDT檢驗(yàn)結(jié)果 D17S810和D17S931因不能提供充足的多態(tài)信息，未進(jìn)行TDT檢驗(yàn)。其余9個(gè)STR多態(tài)位點(diǎn)在103個(gè)核心家系中的基因型分析結(jié)果符合孟德?tīng)栠z傳模式。TDT檢驗(yàn)結(jié)果顯示，位于兩端的D17S1787和D17S787與DDH不存在傳遞不平衡，而D17S855、D17S858、D17S806、D17S1877、D17S941、D17S752及D17S79

11、0與DDH均存在傳遞不平衡。因此，把DDH易感基因的區(qū)域初步定位于D17S855～D17S790之間的約11.70Mb的范圍內(nèi)。 二、COL1A1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)突變篩查 在第67號(hào)家系患兒(67A)的—35位堿基檢測(cè)到了C→T雜合變異(C/T基因型)。同時(shí)對(duì)100例正常人進(jìn)行測(cè)序，也發(fā)現(xiàn)一例相同變異(N—91)。經(jīng)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，未發(fā)現(xiàn)在該位點(diǎn)存在已知多態(tài)，證明在COL1A1的—35位堿基的C→T雜合變異為新發(fā)現(xiàn)的多

12、態(tài)位點(diǎn)，可能與DDH的發(fā)生無(wú)關(guān)。 在第3號(hào)和第69號(hào)家系中的患兒(3A、69A)的第—106位堿基檢測(cè)到C→T雜合變異，同時(shí)對(duì)100例正常人進(jìn)行測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)相同的變異。經(jīng)網(wǎng)上基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)有已知多態(tài)。證實(shí)COL1A1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)—106位堿基的C→T雜合變異為DDH核心家系中新發(fā)現(xiàn)的突變，該突變可能與DDH組織中COL1A1呈低表達(dá)有關(guān)。 三、COL1A1基因啟動(dòng)子區(qū)突變對(duì)其表達(dá)的影響 PCR擴(kuò)

13、增的目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，各產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度與預(yù)期均相符合。構(gòu)建的野生型和突變型PGL3—COL1A1表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序鑒定，基因序列及突變位點(diǎn)與預(yù)期的完全一致，證實(shí)載體構(gòu)建成功。 經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，細(xì)胞培養(yǎng)，熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染野生型PGL3—COL1A1表達(dá)載體的細(xì)胞組，熒光素酶的相對(duì)活性為3.8665，為陰性對(duì)照組(PGL3—basic)的4.8倍；轉(zhuǎn)染突變型PGL3—COL1A1表達(dá)載體的細(xì)胞組，熒光素酶的相對(duì)

14、活性為1.3917，為陰性對(duì)照組的1.7倍。COL1A1基因啟動(dòng)子—106位堿基C→T突變后，其轉(zhuǎn)錄活性較野生型降低了64％，從而證實(shí)該點(diǎn)突變?cè)谵D(zhuǎn)錄水平抑制了COL1A1基因的表達(dá)。 結(jié)論： 1、17號(hào)染色體(17q21.31～17q22)的D17S855～D17S790之間的區(qū)域與DDH有關(guān)聯(lián)，在該區(qū)域內(nèi)可能存在DDH的易感基因。 2、在部分DDH患兒中，COL1A1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的—106位堿基存在C→T