瞬時受體電位通道TRPM7在人鼻咽癌細胞中的表達及其對細胞遷移能力影響的初步研究.pdf

1、研究背景和目的：:
　　 目前惡性腫瘤的治療之所以失敗的因為,一是耐藥性,二是無法防治腫瘤的轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤在診斷時局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率為1/3-1/4。而腫瘤致死亡的主要因為就是腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移,90％腫瘤患者最終死于轉(zhuǎn)移。但當前人們對腫瘤轉(zhuǎn)移機制缺乏系統(tǒng)而深入的認識；現(xiàn)行臨床治療手段對抑制腫瘤轉(zhuǎn)移基本無效；故尋找腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子,揭示腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制便成為當今腫瘤研究面臨的最大挑戰(zhàn)及國際研究的熱點。
　　 腫瘤細胞的侵

2、襲轉(zhuǎn)移涉及腫瘤細胞及間質(zhì)細胞和基質(zhì)之間的多個步驟和分子反應。目前腫瘤轉(zhuǎn)移步驟的模式廣為人們接受的是Liotta提出的癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的三步驟假說:1.腫瘤細胞之間的解黏附和腫瘤細胞與ECM之間的黏附；2.侵足的形成與ECM的降解:腫瘤細胞和宿主細胞分泌的蛋白水解酶,使腫瘤細胞周圍的發(fā)生降解；3.運動,腫瘤細胞被生長因子及趨化因子誘導,向縱深運動。值得一提的是,雖然上述個階段涉及到相對特異的分子機制,但是侵襲轉(zhuǎn)移過程中各階段之間的分子存在交

3、叉和相互作用,因此侵襲轉(zhuǎn)移的階段和分子功能劃分只是相對的。
　　 已有研究證明,正常組織細胞在特殊情況下也具備遷移能力,如胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、免疫細胞。而腫瘤細胞由正常細胞經(jīng)過演變,形成強于正常組織細胞的轉(zhuǎn)移能力。腫瘤細胞雖然具備自身特點,但由于來源于正常組織細胞,因此在很多方面還是原有功能的沿用或是增強。而當今一些腫瘤轉(zhuǎn)移重大發(fā)現(xiàn)采用了類比的方式,跨學科從生理學中尋找對于正常細胞遷移的重要分子,試圖找到對于腫瘤細胞至關(guān)重要的轉(zhuǎn)

4、移相關(guān)因子。比如腫瘤生物學最新研究表明:在胚胎發(fā)育中起重要作用的上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)便是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制之一。我們的研究思路正是采用這種交叉學科間的類比思維,試圖通過尋找在正常細胞中證實已與細胞遷移密切相關(guān)的因子,同時收集5大瘤種10株轉(zhuǎn)移能力不同的腫瘤細胞,從基因和蛋白水平比較,而非采取常規(guī)的高通量基因蛋白芯片,試圖找到與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力相關(guān)的分子而進一步對其進

5、行深入研究。經(jīng)過文獻調(diào)研,我們認為瞬時受體電位通道家族之一的TRPM7可能與腫瘤細胞的遷移相關(guān),初步證據(jù)如下:
　　 瞬時受體電位通道(TRP channels)是位于細胞膜上的一類重要的陽離子通道超家族。TRP通道分為:TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP和TRPML 6大亞家族。TRPM(Melastatin)亞家族包括TRPM1-8,共8種亞型。TRP通道為非選擇性陽離子通道,TRPM7通道主要通過的離子為鈣離

6、子、鈉離子,其還可通過鎂、鋅、錳等很多二價離子。
　　 北京大學程和平等運用共聚焦顯微成像技術(shù),發(fā)現(xiàn)遷移成纖維細胞頭部存在大量微小而短暫的鈣信號事件,即“鈣閃爍”現(xiàn)象,并證明鈣閃爍起著掌控細胞運動“方向舵”的作用。實驗條件下,鈣閃爍被抑制的細胞可以維持直線運動,但完全喪失了定向和轉(zhuǎn)彎的能力。進而提出了“鈣閃爍引導細胞定向遷移”的新觀點:在外界趨化因子梯度誘導下,鈣閃爍發(fā)放呈現(xiàn)不對稱特性,即趨化因子濃度高的一側(cè),鈣閃爍更為活躍,驅(qū)

7、動細胞轉(zhuǎn)向此側(cè),從而精確地調(diào)控細胞的定向遷移。而在文章中作者通過實驗驗證:在所有可能的TRP通道中,TRPM7通道是唯一調(diào)控遷移細胞前端的“鈣閃爍”現(xiàn)象的通道蛋白,即TRPM7才是真正掌控細胞運動的“方向舵”,并以此來指引細胞跟隨趨化因子梯度進而有目的的定向遷移。
　　 此外,Kristopher Clark等發(fā)現(xiàn)在小鼠N1E-115神經(jīng)母細胞瘤細胞中,TRPM7介導緩激肽(BK)誘導的鈣內(nèi)流:同時過表達TRPM7可以促進該細胞

8、的伸展并增強細胞與基質(zhì)之間的粘附；此外TRPM7的激活還可以導致激酶依賴的足體的形成。而對于足體,目前研究表明:正常細胞的足體與腫瘤細胞的侵足關(guān)系密切,人們推測足體是侵入性偽足的前體,在一定條件下形成穩(wěn)定的侵入性偽足。足體在生理物質(zhì)上顯示出降解細胞外基質(zhì)的功能。我們也可以由此推測:TRPM7也可能在腫瘤細胞中通過導致侵足的形成繼而增強腫瘤細胞的侵襲能力。另外,還有研究表明:TRPM7可與細胞膜表面的馬達蛋白myosinⅡ相互作用,從而通

9、過調(diào)控細胞骨架解除細胞與基質(zhì)的粘附進而影響細胞的伸展。
　　 綜上,TRPM7已被證明的一系列細胞遷移相關(guān)的作用與腫瘤細胞遷移、侵襲的各個階段均具有相關(guān)性,故我們大膽推測:TRPM7可能是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控分子。
　　 方法:
　　 1.腫瘤細胞株的選取及TRPM7基因/蛋白水平表達的差異檢測
　　 選取分屬鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、大腸癌、肝癌等5大瘤種中已公認轉(zhuǎn)移能力不同的10株腫瘤細胞株為研究對

10、比對象。運用RT-PCR和Western Blot從基因和蛋白兩個表達水平檢測不同瘤種的腫瘤細胞高低轉(zhuǎn)移能力株之間TRPM7表達量是否存在差異,發(fā)現(xiàn)差異后應用免疫細胞熒光技術(shù)檢測TRPM7在陽性腫瘤細胞株中的表達部位和情況。選取該癌種的高轉(zhuǎn)移細胞(高表達TRPM7)和低轉(zhuǎn)移細胞(低表達TRPM7)分別進行后續(xù)的RNA干擾、基因轉(zhuǎn)染及進一步的功能和機制實驗研究。
　　 2.瞬時干擾TRPM7對人鼻咽癌高轉(zhuǎn)移細胞株5-8F遷移能力的

11、影響
　　 利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)瞬時干擾高表達TRPM7的高轉(zhuǎn)移細胞株5-8F的TRPM7 mRNA表達量,經(jīng)RT-PCR、Western Blot檢驗TRPM7的干擾效果。體外分別用細胞劃痕實驗及transwell小室實驗檢測已成功干擾細胞的遷移能力變化。
　　 3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TRPM7對人鼻咽癌低轉(zhuǎn)移細胞株6-10B遷移能力的影響
　　 hTRPM7/pCDNA4/TO重組表達質(zhì)粒由美國西雅圖兒童醫(yī)院

12、Scharenberg實驗室構(gòu)建并作為禮物贈送我中心實驗室,然后采用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000TM分別將空質(zhì)粒和TRPM7表達質(zhì)粒hTRPM7/pCDNA4/TO轉(zhuǎn)染進入6-10B細胞,用zeocin篩選陽性細胞克隆并擴增培養(yǎng)。并應用誘導劑Doxycycline誘導24小時后,應用RT-PCR與Western Blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的TRPM7基因及蛋白表達水平改變。分別用細胞劃痕實驗及transw

13、ell小室實驗檢測成功轉(zhuǎn)染細胞的遷移能力變化。
　　 4.TRPM7影響5-8F細胞遷移能力機制的初步探討
　　 利用熒光鈣染料Fura-2并通過熒光分光光度計來檢測細胞內(nèi)鈣變化情況,同時應用各種TRPM7離子通道特異性和非特異性的激活劑和阻斷劑來探討TRPM7表達水平對細胞內(nèi)鈣變化影響的機制以及內(nèi)鈣變化對細胞遷移的影響。
　　 結(jié)論
　　 1.TRPM7基因/蛋白在鼻咽癌高轉(zhuǎn)移細胞株5-8F中高表達而在

14、低轉(zhuǎn)移株6-10B中低表達,表明TRPM7可能是促進鼻咽癌轉(zhuǎn)移的潛在轉(zhuǎn)移相關(guān)分子和預后因子。
　　 2.TRPM7的表達高低決定了鼻咽癌細胞遷移能力的高低,提示TRPM7是鼻咽癌細胞的遷移相關(guān)分子。
　　 3.TRPM7是胞內(nèi)鈣變化的主要啟動子和調(diào)控子,提示TRPM7很可能成為鼻咽癌患者治療的靶點。
　　 本研究的創(chuàng)新之處
　　 1.首次發(fā)現(xiàn)TRPM7與腫瘤轉(zhuǎn)移(鼻咽癌細胞遷移)相關(guān),為開展鼻咽癌基因靶向

15、治療初步奠定了理論基礎；
　　 2.初步明確了TRPM7是鼻咽癌胞內(nèi)鈣變化的新的啟動和調(diào)控分子,這對于研究控制鼻咽癌轉(zhuǎn)移提供了一個潛在治療和預后指標；
　　 3.首次闡明了TRPM7如何影響鼻咽癌細胞內(nèi)鈣變化從而影響細胞遷移以及腫瘤細胞內(nèi)存在由TRPM7介導的外鈣內(nèi)流激活的鈣誘導鈣庫釋放(CICR)機制。
　　 4.利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了TRPM7基因過表達的穩(wěn)定鼻咽癌細胞株6-10B/TRPM7+,為研究TRP