基于凝膠蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在前列腺癌研究中的應(yīng)用.pdf

1、基于凝膠蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)提供了蛋白質(zhì)的定量和定性信息，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，尤其是在臨床穿刺樣品的分析中起著核心作用。本文針對基于凝膠蛋白質(zhì)組學(xué)中技術(shù)性強(qiáng)、手工依賴性大、對分析質(zhì)量產(chǎn)生重要影響的3個(gè)環(huán)節(jié)，即雙向電泳(2DE)、蛋白質(zhì)顯色及蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解，進(jìn)行方法學(xué)研究；同時(shí)應(yīng)用基于凝膠蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對前列腺穿刺樣品(PNBX)進(jìn)行前列腺癌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。不僅建立了適用于不同生物樣品的高重復(fù)性、高分辯率的基于凝膠蛋白質(zhì)組學(xué)分析平臺，而且首次

2、揭示了蘊(yùn)含在PNBX中的蛋白質(zhì)組信息，發(fā)現(xiàn)了一些潛在的前列腺癌分子標(biāo)記物。 在方法學(xué)研究部分，本文首先建立并且比較分析兩種雙向電泳體系ISO—DALT和IPG—DAIT。結(jié)果表明IPG—DALT具有更高的分辨率和重復(fù)性，但是，堿性條紋是IPG—DALT中的一個(gè)頑疾。圍繞堿性條紋產(chǎn)生的原因，本文進(jìn)行了一系列的優(yōu)化，包括提高DTT的使用量、縮短等電聚焦時(shí)間、用還原劑TCEP代替DTT并用4—VP烷基化蛋白質(zhì)以及堿性端杯上樣，從而建立

3、了高重復(fù)性、高分辨率、適用于體液(血清和尿液)、細(xì)胞及組織蛋白質(zhì)樣品的雙向電泳分離方法。其次，為了更好地銜接2DE和質(zhì)譜分析，本文以BSA和293T細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品作為生物模型，比較分析了目前被廣泛使用的7種可見蛋白質(zhì)顯色方法(NeuhoffCCB、Bluesilver、LKBSN、HeSN、YanSN、VorumSN及BlumSN)的靈敏度、背景、線性關(guān)系以及MALDI—TOF質(zhì)譜兼容性。從而對各種顯色方法的染色效率及質(zhì)譜兼容性有了全面

4、的了解，對蛋白質(zhì)顯色的化學(xué)原理有了較為深刻的認(rèn)識。其中YanSN染色效率高、質(zhì)譜兼容性良好；NeuhoffCCB質(zhì)譜兼容性好且與YanSN匹配性好。這兩種顯色方法被分別選用于后續(xù)前列腺穿刺樣品蛋白質(zhì)組研究的分析膠和半制備膠的蛋白質(zhì)顯色。最后，為了提高蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的成功率和準(zhǔn)確性，本文在質(zhì)譜樣品制備程序上進(jìn)行摸索，包括探究脫色與否的質(zhì)譜兼容性，分析還原和烷基化處理對蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的影響，及檢測不同酶解時(shí)間的酶解效果，從而建立適用于基于凝

5、膠蛋白質(zhì)組學(xué)研究的蛋白質(zhì)高效膠內(nèi)胰酶酶解程序。 前列腺癌(PCa)是世界范圍的男性高發(fā)疾病，生物學(xué)特性復(fù)雜，是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。PNBX是PCa診斷階段獲得的臨床樣品，其蘊(yùn)涵的蛋白質(zhì)信息，對我們了解PCa極為重要。運(yùn)用所建立的基于凝膠蛋白質(zhì)組學(xué)分析平臺，本文選取PNBX樣品，進(jìn)行PCa的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。首先，本文收集26支來自PCa和前列腺增生(BPH)病人的PNBX樣品。其次，因?yàn)榍傲邢俅┐檀嬖诩s30％的假陰性，本文通過免疫

6、印跡測定樣品中腫瘤標(biāo)記物AMACR的表達(dá)情況，篩選用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的PNBX樣品。繼而，對9支PCaPNBX樣品和14支BPHPNBX樣品進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。2DE結(jié)果顯示52個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在PCa與BPH之間具有顯著差異。包括這些點(diǎn)在內(nèi)的總共228個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)被進(jìn)一步用MALDI—TOF/TOF質(zhì)譜分析鑒定。其中最值得關(guān)注的兩組蛋白質(zhì)是潛在的雄激素受體調(diào)控蛋白(FLNA(7—15)和FKBP4)和參與線粒體脂肪酸β氧化的酶(DCI和E

7、CHS1)。此外，F(xiàn)LNA(7—15)、FKBP4、ECHS1、DCI、CCT6A、和MFAP4在所有PNBX樣品中表現(xiàn)出一致的表達(dá)趨勢，具有一定的作為診斷標(biāo)記物的應(yīng)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)還觀察到：在PCa中抗氧蛋白PRDX各亞型呈現(xiàn)出不均衡表達(dá)；PCa中存在不同修飾狀態(tài)下的HSP27及HSP70.1，而且各種修飾狀態(tài)呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式；一些之前被認(rèn)為是PCa分子標(biāo)記物的蛋白質(zhì)如PSA和ACPP在PCa與BPH的PNBX間沒有顯著差異。通過免疫印