力學(xué)作用下微、納米HA-CS共混體系中微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)對(duì)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1生物學(xué)特性的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　作為身體的支撐框架,骨組織在整個(gè)生命過程中不斷地受到各種力的作用而相應(yīng)地調(diào)節(jié)其質(zhì)量、密度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。成骨細(xì)胞是對(duì)應(yīng)力應(yīng)變信號(hào)進(jìn)行感知的主要力學(xué)敏感性細(xì)胞。骨缺損的修復(fù)及組織工程化骨組織的構(gòu)建,成骨細(xì)胞都是在三維支架內(nèi)部貼壁生長(zhǎng)的。支架材料作為接受外來刺激的主體,將力學(xué)刺激從外部傳遞到細(xì)胞,而細(xì)胞因?yàn)槭艿搅W(xué)刺激,其增殖和分化的速率也將會(huì)發(fā)生改變。因此,研究支架在表觀應(yīng)變下內(nèi)部的應(yīng)變分布對(duì)于研究力學(xué)刺激對(duì)三維支

2、架內(nèi)細(xì)胞的增殖及分化具有重要的意義。Micro-CT技術(shù)能夠非破壞性的獲得支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),通過這些數(shù)據(jù)進(jìn)行重建獲得支架的模型,再用有限元分析不同的力學(xué)刺激下支架內(nèi)部的應(yīng)變分布。在骨移植材料和骨組織工程支架材料中,羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)因能與骨形成很強(qiáng)的化學(xué)結(jié)合具有骨傳導(dǎo)作用而被廣泛應(yīng)用,然而,單一HA的脆性及低疲勞強(qiáng)度限制了其進(jìn)一步應(yīng)用,殼聚糖(Chitosan,CS)因具有無毒性、可生物降解及良好的可加工性

3、而被廣泛應(yīng)用于組織工程研究中,將HA與CS復(fù)合從而增強(qiáng)韌性,并充分發(fā)揮HA良好的生物相容性,有望制備出性能優(yōu)異的骨支架材料。本研究擬制備微、納米HA并與CS共混制備復(fù)合膜及多孔支架材料,考察力學(xué)刺激對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞在微、納米HA/CS復(fù)合膜及多孔支架上的生物學(xué)特性的影響。為骨移植材料的研制、組織工程骨的體外構(gòu)建提供一定的理論依據(jù)和新方法。
　　研究方法：
　　(1)通過將豬骨脫脂脫蛋白、煅燒再球磨的方法制備微米級(jí)HA,

4、通過超聲、攪拌的方法制備納米級(jí)HA。將微、納米級(jí)HA與CS共混制備復(fù)合膜,對(duì)復(fù)合膜進(jìn)行理化性能、細(xì)胞相容性測(cè)試,考察MC3T3-E1細(xì)胞在微、納米HA/CS復(fù)合膜上的增殖和凋亡,優(yōu)選制備三維多孔支架材料的配比。
　　(2)以石蠟微球?yàn)橹驴讋?通過與HA/CS共混溶液混合后鑄模、粒子導(dǎo)出方法制備復(fù)合多孔支架材料。對(duì)制備的復(fù)合支架材料進(jìn)行動(dòng)態(tài)力學(xué)性能測(cè)試及SEM形貌觀察,將成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞接種到支架上,考察支架材料的細(xì)

5、胞相容性;對(duì)支架進(jìn)行Micro-CT掃描獲得微觀結(jié)構(gòu)參數(shù),并考察復(fù)合支架的體外酶解過程。
　　(3)應(yīng)用Micro-CT掃描得到的材料結(jié)構(gòu)參數(shù),有限元建模后分析材料在施加不同的表觀應(yīng)變時(shí)內(nèi)部的應(yīng)變分布,優(yōu)選出適合的表觀應(yīng)變。對(duì)細(xì)胞/支架復(fù)合物施加波形為正弦波、頻率為1Hz、表觀應(yīng)變3000με的動(dòng)態(tài)壓載荷、10min/次,1次/d,7d、14d后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè):SEM觀察細(xì)胞在支架上受力后的形態(tài)變化,檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡,ELISA檢

6、測(cè)ALP含量,Real-timePCR檢測(cè)BMP-2、ColI、OCNmRNA表達(dá),Westernblot檢測(cè)BMP-2、ColI、OCN蛋白含量。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　(1)通過對(duì)松質(zhì)骨脫脂脫蛋白再煅燒、球磨的方法,可以獲得粒徑較為均一的微米級(jí)天然HA粒子,中值粒徑D50在1.21～1.67范圍內(nèi)。采用超聲、攪拌的方法制備了納米級(jí)的直徑約5nm、長(zhǎng)約50nm的棒狀HA粒子。將微、納米HA與CS共混制備HA/CS復(fù)合膜,SE

7、M顯示HA在基質(zhì)CS中分布較均勻,二者結(jié)合緊密,復(fù)合膜具有較好的力學(xué)性能,在CS中加入HA可以克服HA的顆粒流動(dòng)性的缺點(diǎn)。比較球磨工藝及原料配比對(duì)成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1增殖及形態(tài)的影響,優(yōu)選出9號(hào)復(fù)合膜的配比制備下一步的多孔支架,細(xì)胞在微、納米HA/CS復(fù)合膜上的增殖、凋亡沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在復(fù)合膜材料上檢測(cè)細(xì)胞相容性更加直觀,為下一步制備多孔支架材料提供了理論依據(jù)。
　　(2)以石蠟微球?yàn)橹驴讋┩ㄟ^粒子導(dǎo)出方法制備了微、納米

8、級(jí)HA/CS復(fù)合支架材料,隨著致孔劑含量的增加,支架的孔隙連通性增加。實(shí)驗(yàn)證實(shí),球形致孔劑制備的支架在孔隙連通性方面較立方體致孔劑更具有優(yōu)勢(shì)。對(duì)復(fù)合支架分別進(jìn)行動(dòng)態(tài)力學(xué)性能測(cè)試,支架表現(xiàn)出粘彈性和滯后效應(yīng)。綜合力學(xué)性能和SEM結(jié)果,優(yōu)選復(fù)合溶液與石蠟微球比例為50:70的支架為下一步實(shí)驗(yàn)用支架。經(jīng)Micro-CT掃描后獲得的微、納米HA/CS復(fù)合支架的微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)基本一致,將Micro-CT掃描后獲得的圖像在Mimics中建模,可以看出

9、制備的支架具有良好的孔隙連通性。微、納米HA/CS復(fù)合支架具有良好的細(xì)胞相容性,成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1能在支架孔壁上黏附、增殖。微、納米HA/CS復(fù)合支架在溶菌酶的PBS溶液中可以發(fā)生降解,在前4w降解速率較低,在4～8w降解速率大大提高,降解液中有還原糖生成,且其含量隨降解時(shí)間的延長(zhǎng)呈增大趨勢(shì)。
　　(3)用基于Micro-CT的有限元方法,計(jì)算了不同表觀應(yīng)變下復(fù)合支架內(nèi)部的應(yīng)變分布,存在應(yīng)力集中現(xiàn)象,計(jì)算出應(yīng)施加的最佳表

10、觀應(yīng)變?yōu)?000με。對(duì)細(xì)胞/支架復(fù)合物施加動(dòng)態(tài)壓載荷后,SEM結(jié)果表明細(xì)胞在微、納米HA/CS支架上可黏附、增殖,7d時(shí)細(xì)胞呈梭形、不規(guī)則狀,有部分集落,14d細(xì)胞逐漸融合成片,幾乎長(zhǎng)滿支架表層的孔隙。Real-timePCR和Western結(jié)果顯示ColⅠmRNA及蛋白表達(dá)在14d均高于對(duì)照組,而OCN蛋白表達(dá)在7d、14d與對(duì)照組無顯著性差異,表明細(xì)胞還未完全分化成熟。ALP蛋白表達(dá)在7d時(shí)明顯升高,14d時(shí)又下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示基

11、因mRNA達(dá)與蛋白表達(dá)二者間并沒有完全的一致性。
　　結(jié)論：
　　(1)通過球磨法可制備微米級(jí)HA粒子,通過超聲、攪拌的方法可制備出納米級(jí)HA粒子,但將二者與CS共混成膜后尺度效應(yīng)不夠明顯,對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的黏附、增殖、凋亡無明顯影響,可能是HA發(fā)生團(tuán)聚所致。
　　(2)應(yīng)用石蠟微球做致孔劑可以得到孔隙連通性良好的微、納米HA/CS復(fù)合支架材料,隨著致孔劑含量的增加,支架的孔隙連通性增加。同法制備的微、納米HA/