三維培養(yǎng)條件下動態(tài)載荷對MC3T3-E1成骨樣細胞生物學效應影響的研究.pdf

1、研究目的：
　　 本文采用智能材料-壓電陶瓷裝置，通過檢測MC3T3-E1成骨樣細胞增殖活性、細胞分化特異基因表達探討三維培養(yǎng)條件下細胞對不同力學強度的生物學響應。
　　 材料與方法：
　　 1.采用冷凍干燥制備不同質量比殼聚糖/羥基磷灰石/脫鈣骨基質(chitosan/hydroxyapatite/demineralized bone matrix，CS/HA/DBM)復合支架材料。掃描電鏡(scanning

2、electron microscopy，SEM)觀察其形貌，Micro-CT分析支架的微結構，材料試驗機測試不同質量比CS/HA/DBM復合材料的壓縮彈性模量和壓縮強度。采用體外培養(yǎng)細胞的方法，將成骨前體細胞MC3T3-E1直接接種到CS/HA/DBM三維支架材料上，共培養(yǎng)1、3、5、7d，采用MTS方法繪制細胞增殖曲線，SEM、組織化學染色觀察細胞形態(tài)。選擇后期實驗用材料及最佳加載時間。
　　 2.采用有限元(finite e

3、lement，F(xiàn)E)分析方法計算三維(three-dimensional，3D)支架內部單個細胞所受到的作用力大小及相關力學參數(shù)，根據(jù)此數(shù)據(jù)來優(yōu)化工程化骨組織體外構建的力學刺激條件，采用智能材料-壓電陶瓷對細胞-支架材料復合物進行力學加載。
　　 3.根據(jù)CS/HA/DBM復合支架材料生物相容性研究結果和實驗室前期結果，將加載條件設定為每次1h，1次/d，連續(xù)6d，頻率為1Hz，工作應變?yōu)?με、1200με、2800με、70

4、00με，用MTS檢測細胞增殖情況，采用RT-PCR方法測定特異基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、Runx2或稱核心結合因子(core bindingfactor al，Cbfa1)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ，ColⅠ)及骨鈣素(osteocalcin，OCN)的基因表達情況，采用WesternBl

5、ot方法測定BMP-2、Runx2的蛋白表達情況。
　　 研究結果：
　　 1.通過冷凍干燥法制備出具有良好相互連通孔隙結構(>100μm)的3D材料。CS/HA/DBM復合材料具有連通的多孔結構，孔隙率為48％-65％，材料的平均壓縮模量和最終壓縮強度分別為3-6 kPa和11-24 kPa。在DBM一定的情況下，隨著HA量的增加，體積分數(shù)(volume fraction)增加，支架孔壁厚度(trabecularthi

6、ckness，Tb.Th)和支架孔隙間隙(trabecular separation)增加，但支架表面積/體積比(bone surface/volume ratio，BS/BV)減少，總的孔隙率(total porosity)降低。
　　 2.參照生理載荷范圍，根據(jù)有限元計算的支架材料內部應變分布，確定實驗表觀加載應變?yōu)?με、1200με、2800με、7000με。施加1200με表觀加載應變時，內部應變60％在1000με

7、-2000με之間，但主要集中在1000με；施加2800με表觀加載應變時，內部應變60％在1000με-2000με之間，但主要集中在2000με；施加7000με表觀加載應變時，內部應變60％大于5000με。四組樣品在支架孔壁處存在應力集中現(xiàn)象。
　　 3.細胞增殖曲線說明7000με的壓縮應變抑制細胞增殖。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，在1200με、2800με的壓縮應變作用下，細胞增殖速度快，數(shù)量增多。
　　 4.RT-

8、PCR以及Western Blot結果顯示，與靜態(tài)培養(yǎng)組相比，1200με、2800με壓縮應變促進了成骨分化特異基因BMP-2、Runx2、ALP、ColⅠ及OCN的表達，2800με壓縮應變條件下表達最強，而7000με壓縮應變抑制其表達。
　　 研究結論：
　　 1.六種材料中3 wt％HA材料組具有理想的孔隙結構(>100μm)。MC3T3-E1成骨前體細胞易在CS/HA/DBM三維支架材料上黏附、增殖，表明該支

9、架材料具有良好的生物相容性。根據(jù)材料結構參數(shù)、力學特性及細胞相容性結果確定質量比3:3:1.5組的支架材料作為后期實驗材料。根據(jù)細胞增殖曲線確定壓縮應變時間為6d。
　　 2.壓縮應變可促進成骨，為研究力學作用增加骨強度提供了一個分子模型。合適的力學刺激作用下細胞的生物學響應表明力學刺激在促進骨折愈合中的重要性。研究結果還表明超生理力學刺激抑制細胞的增殖。
　　 3.通過有限元分析方法得到了支架材料局部各處的應變分布，計