神經(jīng)生長因子在子宮腺肌病疼痛中的作用及其相關(guān)機制研究.pdf

1、子宮腺肌病是一種子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)侵入子宮肌層,伴隨子宮局灶或彌漫性增大的良性疾病。此病多發(fā)生于40歲以上的經(jīng)產(chǎn)婦,患病率為5％～70％,子宮切除后腺肌病灶的檢出率約為30％～60％。臨床表現(xiàn)主要為經(jīng)量增多和經(jīng)期延長,以及逐漸加劇的進行性痛經(jīng)。子宮腺肌病患者的痛經(jīng)率高達64.8％～77.8％,此外還可以出現(xiàn)慢性盆腔痛、排便痛及性交痛。疼痛嚴重影響了女性的生殖健康和生活質(zhì)量,但其機制尚未完全明確。神經(jīng)生長因子(nerve growth f

2、actor,NGF)是一類在疼痛過程中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的神經(jīng)因子,主要通過低親和力的P75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)與高親和力的酪氨酸激酶受體A(tyrosine kinase A,trkA)發(fā)揮生物學作用,參與疼痛發(fā)生、發(fā)展的各個環(huán)節(jié)。研究表明NGF在內(nèi)異癥患者異位內(nèi)膜高表達,且與疼痛相關(guān),可能成為內(nèi)異癥及腺肌病疼痛研究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　本課題檢測NGF在腺肌病患者或動

3、物模型子宮及脊髓背根神經(jīng)節(jié)的表達變化,研究NGF表達與腺肌病本身及疼痛程度的關(guān)系,分析可能誘發(fā)NGF變化的原因,并通過檢測NGF相關(guān)的神經(jīng)植入、疼痛受體、局部炎癥、中樞敏感性的變化,及NGF對腺肌病灶內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖、凋亡、雌激素合成關(guān)鍵酶表達的作用,探討NGF參與子宮腺肌病疼痛的機制。
　　第一部分:子宮腺肌病患者腺肌灶NGF表達與神經(jīng)植入及疼痛程度的關(guān)系
　　目的:研究NGF在子宮腺肌病患者病灶內(nèi)膜的表達及其與患者疼痛評

4、分及病灶局部神經(jīng)植入密度的關(guān)系。
　　方法:選擇2009年3月～10月在復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院院行子宮切除的腺肌病患者45例,子宮切除且否認疼痛的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅲ期及子宮肌瘤患者共26例,所有病例均經(jīng)病理組織學確診。于術(shù)中取腺肌病患者病灶內(nèi)膜或子宮肌瘤及CIN患者在位內(nèi)膜,免疫組化法顯示神經(jīng)生長因子(NGF)表達;免疫熒光法顯示蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)陽性神經(jīng)纖維植入;視覺評分系統(tǒng)(VAS)評測腺肌病患者痛經(jīng)、

5、慢性盆腔痛及性交痛的程度。
　　結(jié)果:腺肌病疼痛組患者病灶NGF表達強度及PGP9.5陽性神經(jīng)纖維植入密度高于腺肌病無痛組及對照組(p＜0.05);腺肌病痛經(jīng)重痛組NGF表達強度及PGP9.5陽性神經(jīng)纖維植入密度高于腺肌病痛經(jīng)輕中痛組及對照組(p＜0.05);NGF表達強度及PGP9.5陽性神經(jīng)纖維植入密度與腺肌病患者是否出現(xiàn)慢性盆腔痛及性交痛無關(guān);腺肌病患者病灶NGF表達強度與PGP9.5陽性神經(jīng)纖維密度變化具有相關(guān)性(r=0.

6、31,p＜0.05)。
　　結(jié)論:腺肌病患者病灶處NGF高表達可能參了患者痛經(jīng)的發(fā)生機制,而促進病灶內(nèi)膜神經(jīng)纖維植入是其機制之一。
　　第二部分:NGF及其受體在子宮腺肌病小鼠子宮及脊髓背根神經(jīng)節(jié)的表達
　　目的:使用口服他莫昔芬法建立ICR小鼠子宮腺肌病模型并鑒定;檢測NGF及其受體在腺肌病小鼠模型子宮及脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRGs)的表達隨動情周期及病情進展的變化。
　　方法:新生ICR小鼠連續(xù)4d滴喂他莫昔芬為

7、造模組,并與同齡對照小鼠分別于42d、85～95d、135～145d、185～195d、235～245d齡處死(每組4～5只),取雙子宮及T13至L2脊髓背根神經(jīng)節(jié)。使用蘇木素-伊紅染色檢測子宮病理改變;陰道脫落細胞法檢測動情周期變化;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測子宮緩激肽受體1(BKR-1)、神經(jīng)激肽1受體(NK1-R)的基因表達;免疫組化補體31(CD31)染色計算子宮微血管的密度、直徑及所占面積比;免疫組化PGP9.5

8、及SP染色計算神經(jīng)纖維密度;免疫組化檢測NGF及其受體在子宮的表達;蛋白印跡(Western-bolt)檢測子宮NGF及其受體蛋白水平隨動情周期及鼠齡增加的變化;實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(Real-timeRTPCR)檢測DRGs中NGF受體mRNA水平隨鼠齡增加的變化。
　　結(jié)果:使用口服他莫昔芬法建立ICR小鼠子宮腺肌病模型的造模率為100％,且疾病嚴重程度隨鼠齡增加進展;85～95d及135～145d齡造模小鼠子宮肌層微血

9、管密度和面積比均高于對照小鼠(p＜0.05);135～145d造模小鼠子宮內(nèi)膜及肌層PGP9.5陽性神經(jīng)纖維、內(nèi)膜SP陽性神經(jīng)纖維植入密度高于對照組(p＜0.05);135～145d造模小鼠子宮BKR-1、NK1-R的基因表達較對照組明顯升高(p＜0.05);免疫組化結(jié)果顯示NGF在小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞和間質(zhì)細胞表達,p75NTR在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞表達,trkA在子宮內(nèi)膜上皮細胞及神經(jīng)纖維表達;Western-bolt結(jié)果表明135～1

10、45d腺肌病鼠及對照鼠子宮NGF及其受體的表達隨動情周期變化波動,NGF及p75表達水平在動情前期達高峰,trkA在動情期達高峰(p＜0.05);85～95d腺肌病小鼠NGF及其受體表達強度與對照組無差異,135～145d腺肌病小鼠子宮出現(xiàn)NGF前體及p75NTR表達增高(p＜0.05),且隨鼠齡增長腺肌病鼠子宮NGF、NGF前體及NGF受體的蛋白水平(p＜0.05),DRGs中trkA的mRNA水平均增高(p＜0.05),對照鼠未見此

11、變化。
　　結(jié)論:口服他莫昔芬法可有效建立ICR小鼠子宮腺肌病模型,模型小鼠出現(xiàn)腺肌病特征性病理改變及血管、神經(jīng)、炎癥、疼痛相關(guān)受體的表達異常,病情隨鼠齡進展:腺肌病及對照小鼠子宮NGF及受體的表達受動情周期調(diào)節(jié),隨疾病進展增強;腺肌病小鼠DRGs中trkA表達增強可能是中樞神經(jīng)敏感性增強的原因之一;腺肌病子宮NGF表達與BKR-1及NK1-R所反映的局部組織、神經(jīng)炎癥變化一致。
　　第三部分:腺肌病患者異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞NG

12、F表達的影響因素及其對間質(zhì)細胞的調(diào)控作用研究
　　目的:研究影響腺肌病患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞NGF表達的因素及NGF對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖、凋亡、雌激素合成的作用。
　　方法:選擇2009年5月～10月在復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院院行子宮切除的腺肌病患者為實驗組,子宮切除宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅲ期及子宮肌瘤患者為對照組。于術(shù)中取實驗組病灶內(nèi)膜或?qū)φ战M在位內(nèi)膜分離子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(ESC)并行原代培養(yǎng)。免疫組化法顯示ESC的NGF

13、及其受體表達;于培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度17β-雌二醇、腫瘤壞死因子(TNF)及氯化鈷(CoCl2),western-bolt檢測實驗組及對照組ESC合成NGF蛋白水平的變化;于培養(yǎng)體系中加入不同濃度NGF,MTT法檢測兩組ESC增殖變化,tealtimeRT-PCR與western-bolt法分別檢測兩組ESC合成芳香化酶的mRNA及蛋白水平變化;培養(yǎng)體系中加入H2O2或CoCl2誘導ESC凋亡并加入不同濃度NGF,MTT法檢測ES

14、C凋亡變化。
　　結(jié)果:腺肌病及對照組ESC均表達NGF及其受體p75NTR,均不表達trkA。外源性17β-雌二醇可促進腺肌病ESC合成NGF,但對對照組ESC無此作用;外源性TNF可促進腺肌病組與對照組NGF的合成;CoCl2缺氧可降低對照組ESC合成NGF,但對腺肌病ESC無此作用;外源性NGF可明顯促進腺肌病ESC增殖及芳香化酶的合成,但對對照組ESC無此作用;外源性NGF對兩組ESCH2O2及CoCl2誘導的凋亡均無保護