人B7-H4單克隆抗體的制備.pdf

1、B7-H4(B7S1、B7x)屬于免疫球蛋白超家族，為B7家族成員，能通過抑制T細胞增殖、細胞因子的產(chǎn)生和細胞周期的進程來負性調(diào)節(jié)T細胞的免疫應(yīng)答，其在多種腫瘤組織中的高表達，與腫瘤的免疫逃逸關(guān)系密切，并已被確認是某些腫瘤的新型腫瘤標(biāo)志物。
　　 [目的]
　　 制備鼠抗人BT-H4單克隆抗體，并對其進行初步鑒定，為進一步研制B7-H4檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.IPTG誘導(dǎo)hB7-H

2、4胞外區(qū)融合蛋白表達，SDS-PAGE電泳鑒定，將重組基因工程菌擴大誘導(dǎo)表達，親和層析法純化誘導(dǎo)的蛋白。
　　 2.將純化的蛋白與弗氏佐劑乳化，將其作為抗原免疫BALB/c雌性小鼠。
　　 3.融合骨髓瘤細胞與脾淋巴細胞，采用酶聯(lián)免疫技術(shù)篩選陽性雜交瘤細胞，有限稀釋法對陽性細胞進行克隆化。
　　 4.將雜交瘤接種于BALB/c雌性小鼠腹腔中誘導(dǎo)產(chǎn)生腹水，采用親和層析法純化腹水中單抗。
　　 5.Weste

3、rn blot鑒定單克隆抗體。
　　 [結(jié)果]
　　 1.蛋白的表達與純化：制備的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定，其純度達到電泳純，可用做單抗制備的靶抗原。
　　 2.單抗的制備與鑒定：用純化的hB7-H4融合蛋白免疫BALB/c小鼠，對小鼠外周血多抗效價檢測，結(jié)果其雙向瓊脂擴散效價為1:16，ELISA效價達1:12800，提示小鼠免疫成功。經(jīng)細胞融合、篩選、克隆化后得到了持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人B7-H4單克隆抗