AMACR和Galectin-4蛋白聯(lián)合作為肝細胞癌術(shù)后早期復發(fā)轉(zhuǎn)移標志物的研究.pdf

1、肝細胞癌（以下簡稱肝癌）是世界上最為常見的惡性腫瘤之一，每年約有667000個新發(fā)病例，并且在中國是第二大導致死亡的癌癥。肝細胞癌的高死亡率主要是與其高的術(shù)后復發(fā)率有關(guān)，約有75％的患者術(shù)后會出現(xiàn)肝內(nèi)或肝外的轉(zhuǎn)移。近年來，隨著影像學的發(fā)展，肝癌術(shù)后復發(fā)的早期診斷率有所提高，但其昂貴的檢查費用，仍不適合作為常規(guī)的頻繁檢測項目。因此尋找能判斷肝癌早期復發(fā)轉(zhuǎn)移的生物學標志物，預測肝癌復發(fā)的風險變得迫在眉睫。AMACR和galectin-4這兩

2、種蛋白已經(jīng)被證實與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相聯(lián)系，我們前期的蛋白質(zhì)組學研究也發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白與肝癌早期復發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但是查閱相關(guān)文獻并沒有發(fā)現(xiàn)其有關(guān)的臨床報道，并且它們對肝癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的作用機制也不得而知。
　　目的：⑴檢測AMACR和galectin-4蛋白在肝癌組織中的表達，結(jié)合臨床病理等資料，評價其作為預測肝細胞癌術(shù)后早期復發(fā)轉(zhuǎn)移風險的分子標志物的能力；⑵評價AMACR和galectin-4兩種蛋白聯(lián)合作為肝細胞癌術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移標志物的

3、臨床診斷能力；⑶通過在體和體外實驗闡明AMACR和galectin-4蛋白影響肝細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制。
　　方法：①分別選取術(shù)后早期復發(fā)，晚期復發(fā)及未復發(fā)病例行Q-PCR檢測各組肝癌組織中 AMACR mRNA水平。取158例肝癌組織構(gòu)建組織芯片，免疫組化檢測AMACR蛋白表達水平，分析各臨床病理參數(shù)與 AMACR蛋白表達量關(guān)系，評價AMACR蛋白作為判斷肝細胞癌術(shù)后早期復發(fā)轉(zhuǎn)移標志物的潛能。②分別選取術(shù)后早期復發(fā)，晚期復發(fā)及

4、未復發(fā)病例行 Q-PCR、WB檢測各組galectin-4的mRNA和蛋白水平。取201例肝癌患組織構(gòu)建組織芯片，免疫組化檢測galectin-4蛋白表達水平，分析比較臨床病理參數(shù)與galectin-4的表達量的關(guān)系。③ELESA實驗檢測肝癌患者血清中AMACR和galectin-4的含量，利用Logistic回歸分析繪制受試者工作特征曲線，并計算最佳診斷臨界值及其相對應的敏感度和特異度，評價該聯(lián)合標志物的診斷價值。④利用pcDNA3.

5、1質(zhì)粒載體分別構(gòu)建穩(wěn)定高表達AMACR、galectin-4肝癌細胞株以及沉默表達AMACR、galectin-4的肝癌細胞株，Transwell實驗檢測各細胞株轉(zhuǎn)移和侵襲能力；裸鼠皮下成瘤實驗評價AMACR和galectin-4蛋白在體內(nèi)對腫瘤的影響；定量蛋白質(zhì)組實驗對高表達和敲除galectin-4的穩(wěn)定細胞株進行比較定量分析，展現(xiàn)由 galectin-4引起的肝癌細胞的蛋白質(zhì)組表達差異譜，進一步探討galectin-4對肝癌細胞轉(zhuǎn)

6、移和侵襲作用機制的影響。
　　結(jié)果：⑴Q-PCR結(jié)果顯示AMACR在早期復發(fā)轉(zhuǎn)移的肝細胞癌中在mRNA水平上表達明顯下降（P=0.004）；組織芯片檢測發(fā)現(xiàn)AMACR蛋白低表達與AFP血清水平（P=0.012），腫瘤數(shù)目（P=0.005），區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.042），腫瘤包膜（P=0.026）以及門靜脈癌栓（P=0.049）相關(guān)。158例肝癌術(shù)后生存率單因素分析發(fā)現(xiàn)：術(shù)中腹水、腫瘤大小、腫瘤包膜完整度、腫瘤分化程度、門靜脈癌

7、栓以及 AMACR蛋白表達量與術(shù)后生存時間相關(guān)；多因素分析顯示，AMACR蛋白可以作為預后的獨立判斷因素（P=0.031）。Kaplan-Meier分析結(jié)果示：低表達 AMACR蛋白的患者其中位生存期較高表達組短（log-rank，P<0.001）。⑵Q-PCR和WB結(jié)果顯示galectin-4在早期復發(fā)轉(zhuǎn)移組的肝細胞癌中mRNA水平及蛋白水平表達都有明顯的下降。組織芯片檢測發(fā)現(xiàn)galectin-4蛋白低表達與腫瘤大?。≒=0.036）

8、，組織的低分化（P=0.011），微血管侵犯（P=0.004）以及TNM處于更晚期（P=0.015）相關(guān)。201例肝癌術(shù)后生存率單因素分析發(fā)現(xiàn)：腫瘤大小、腫瘤包膜完整度、腫瘤分化程度、門靜脈癌栓，TMN分期以及 galectin-4蛋白表達量與術(shù)后生存時間相關(guān)；多因素分析顯示galectin-4是判斷肝細胞癌術(shù)后總生存期（P=0.002）的獨立因素。Kaplan-Meier分析結(jié)果表明galectin-4低表達患者較高表達患者具有更高的

9、轉(zhuǎn)移復發(fā)率（log-rank，P<0.001）及更短的總生存期（log-rank，P<0.001）。⑶在早期復發(fā)轉(zhuǎn)移的肝癌患者中，血清AMACR及galectin-4含量要明顯高于晚期復發(fā)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05）。以165.5 pg/ml作為AMACR診斷早期復發(fā)轉(zhuǎn)移肝癌的臨界值其靈敏度和特異度分別為0.407及1。同樣，將3367.5 pg/mL作為galectin-4診斷早期復發(fā)轉(zhuǎn)移肝癌的臨界值其靈敏度和特異度分別為0.852及0.

10、524。兩種蛋白的曲線下面積分別是0.703（P=0.025）和0.712（P=0.019）。將兩者結(jié)合繪制ROC曲線得到其曲線下面積為0.799（P<0.000）,診斷價值明顯提升。⑷Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，下調(diào)galectin-4蛋白表達量能顯著增加肝癌細胞株的轉(zhuǎn)移和侵襲能力；下調(diào) AMACR蛋白的表達量在體外對肝癌細胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力沒有明顯影響。裸鼠皮下成瘤實驗示：低表達galectin-4蛋白的肝細胞癌其腫瘤生長速度較高表達

11、galectin-4蛋白的肝細胞癌明顯增快（P=0.0496）。而AMAR蛋白對皮下腫瘤生長的影響不明顯。蛋白質(zhì)組學分析顯示：改變肝癌細胞株中g(shù)alectin-4蛋白表達量能引起127種蛋白表達譜產(chǎn)生較大差異，其多數(shù)蛋白參與肝癌細胞的轉(zhuǎn)錄翻譯以及脂肪酸、氨基酸代謝等生物學過程。
　　結(jié)論：①AMACR和galectin-4蛋白肝癌組織中的低表達可能與術(shù)后早期復發(fā)相關(guān)，可以作為肝細胞癌術(shù)后早期復發(fā)轉(zhuǎn)移的預后標志物；②聯(lián)合檢測AMAC