重組人Ⅶ型膠原蛋白對營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥治療作用的實驗研究.pdf

1、前言：
　　營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥（Dystrophic Epidermolysis Bullosa，DEB）是一類由人體VII類蛋白基因（Type VII Collagen，C7）突變或缺失引起的機械性大皰性疾病。其特征是易受損的皮膚，真表皮脫離甚至剝落導致水皰的形成，從而留下瘢痕。不僅如此，病人常常會因為皮膚的反復潰爛而導致四肢的殘缺，還會因為口腔粘膜和食道的潰爛導致進食飲水的困難。由此，長期的皮膚及粘膜反復潰爛結疤會發(fā)展

2、成惡性鱗狀上皮細胞癌。多數(shù)患者在年幼時因為該疾病而早夭。DEB分為營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥亞型（DDEB）和隱性營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥亞型（RDEB）兩種。
　　DEB已給數(shù)以千計的家庭帶來痛苦。在這些病人中有超過三百種不同的C7變異亞型。C7基因的突變導致了錨原纖維合成和裝配的異常，以及真表皮之間的黏附。最嚴重的DEB亞型為隱性DEB（the Hallopeau-Siemens型，HS-RDEB），其C7及錨原纖維均缺失。

3、所以，HS-RDEB表征為嚴重的皮膚水皰，極易受損的皮膚，多層瘢痕引起的手足殘缺、關節(jié)攣縮和食道狹窄。HS-RDEB病人在其二十至四十歲期間由于長期性的皮膚創(chuàng)傷會引發(fā)侵襲性鱗狀細胞癌而導致癌細胞的轉移乃致死亡。
　　C7是錨原纖維的主要成分，而錨原纖維則是皮膚基底膜帶用來“連接”真皮與表皮的附屬結構。C7基因由三條相同的α鏈組成，每條α鏈都包括了一個大小為145kDa，重復編碼為Gly-X-Y的膠原性氨基酸三螺旋結構，一個145k

4、Da的非膠原性片斷位于氨基端（NC1），羧基端也是一個非膠原性片斷，不過大小只有34kDa（NC2）。NC1基端被公認為可作用于BMZ的一端，并且也是IV膠原蛋白的氨基終端。
　　本實驗運用具有免疫活性的不表達COL7A1基因敲除小鼠模型（其臨床癥狀類似于人類RDEB患者），采用分子生物學和免疫學等實驗研究技術，探討和研究了C7蛋白基因對遺傳性RDEB的治療作用，為C7蛋白基因藥物的進一步研發(fā)奠定基礎。
　　1、研究目的：<

5、br>　　研究重組人C7基因的體內、外表達；為DEB的治療提供臨床前研究實驗依據(jù)。
　　2、實驗方法：
　　2.1、重組C7外表達的修復
　　2.1.1、細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM/Ham’sF12（1:1）培養(yǎng)基中，永生化培養(yǎng)RDEB成纖維細胞(原代RDEB成纖維細胞來自于斯坦福大學的S.Herron)，培養(yǎng)箱溫度為37°C，及5％CO2。
　　2.1.2、慢病毒載體的基因轉染將全長8850bp的C7

6、基因亞克隆進入慢病毒轉染載體SMPU的聚合接點序列，且恰好位于內部啟動子MND的下游，然后將構建好的攜帶有C7的病毒轉染入RDEB成纖維細胞。
　　2.1.3、免疫熒光染色以免疫熒光染色法檢驗RDEB成纖維細胞的轉染質量。
　　2.1.4、C7的純化及分析免疫印跡實驗中，經轉染的RDEB成纖維細胞長到匯合，加入含150μM的抗壞血酸條件培養(yǎng)液中生長24小時。收集培養(yǎng)液，加入絲氨酸蛋白酶抑制劑，用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳法定量定

7、性。Western印跡測試中，我們用C7的NC1域作為多克隆抗體由而探測到C7的存在。在大量純化重組C7中，含有絲氨酸蛋白酶抑制劑和硫酸銨的無血清培養(yǎng)液攪拌過夜，透析，然后離心使不溶物質沉淀，再將沉淀物重新溶解，過Q-瓊脂糖（Amersham Biosciences，Inc.），NaCl線性梯度洗脫，最終C7保存于1M-NaCl中。
　　2.2、重組C7體內表達的修復
　　2.2.1、C7顯性缺失小鼠的鑒別C7顯性缺失小鼠（

8、C57B/L系列）也被稱為DEB小鼠，在其出生之后即可從爪部和/或腹部的紅色水泡辨別其特征。
　　2.2.2、C7隱性缺失小鼠的鑒別C7隱性缺失小鼠必須采用聚合酶鏈反應（PCR）才能確認其基因型。
　　2.2.3、C7對C7顯性缺失小鼠的治療每日在DEB小鼠的背部皮下注射一定量的COL7A1（C7），根據(jù)小鼠存活時間（4天至7個月不等），累計注射到每只DEB小鼠的C7量從20μgto300μg不等。
　　2.2.4、皮

9、膚組織的免疫熒光染色及超微結構分析嵌入OCT中的組織在低溫保持器中切成5μm厚，以丙酮固定，然后用能識別小鼠C7及人C7的兔多克隆抗體進行培育，再用摻有CY3的羊抗兔IgG抗體結合。樣本用40％的甘油隔絕空氣之后，Zeiss Axioplan熒光顯微鏡和Zeiss Axiocam MRM數(shù)碼相機完成檢測及拍攝。
　　2.2.5、重組NC1的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）體循環(huán)中產生的抗C7抗體用ELISA法測定。不同時間點從6只注

10、射了C7的DEB小鼠提取血清，以NCL作參比對照，分析抗C7抗體的濃度。
　　2.2.6、治療組MR1和對照組IgG比較3只DEB小鼠腹腔注射MR1，其對照組的3只DEB小鼠注射倉鼠IgG?；谥暗膱蟮溃覀冋归_了MR1的劑量反應研究。首日2×10-2μg/kg，第2，4，7，14，21，28天劑量依次為1×10-2μg/kg。每月收集一次血清樣本，ELISA法定量。
　　3、實驗結果：
　　3.1、重組VII膠原蛋

11、白體外表達的修復
　　3.1.1、運用慢病毒載體進行基因轉染全長8850bp的C7基因被亞克隆進慢病毒轉染載體SMPU的聚合接點序列，且恰好位于內部啟動子MND的下游。經轉染的RDEB成纖維細胞也攜帶C7的cDNA。
　　3.1.2、免疫熒光染色細胞95％呈陽性結果，熒光顯微鏡下檢測，之后拍照。
　　3.1.3、C7的純化及分析Western印跡法和coomassie藍染色法定性和定量及純化C7。
　　3.2、重

12、組C7體內表達的修復
　　3.2.1、C7顯性缺失小鼠的鑒別采用C7治療。
　　3.2.2、C7隱性缺失小鼠的鑒別C7隱性缺失小鼠被用來繁殖。
　　3.2.3、C7對C7顯性缺失小鼠的治療C7注射兩到三次后，小鼠水皰癥狀減輕，并無新水皰形成。
　　3.2.4、皮膚組織的免疫熒光染色及超微結構分析經染色的基底膜帶可觀測到陽性反應，錨原纖維結構得到矯正以及重新形成，由此可以證明DEB小鼠皮膚組織中主要的超微結構異常得