CpG ODN對(duì)人初始B細(xì)胞提呈HBV表位的影響.pdf

1、B淋巴細(xì)胞誘發(fā)的體液免疫在乙肝病毒清除中的重要作用已經(jīng)成為共識(shí)。而初始B細(xì)胞作為一種APC，尤其是在誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用仍然存在爭(zhēng)議。初始B細(xì)胞不能誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞對(duì)抗原的應(yīng)答至少部分是由于自身相對(duì)較低的共刺激分子表達(dá)造成的，因?yàn)槌跏糂細(xì)胞的共刺激分子表達(dá)可能增加其APC功能。B細(xì)胞APC活性的另一個(gè)重大缺陷在于有特定抗原受體的初始B細(xì)胞的數(shù)量很少，造成抗原識(shí)別和受體介導(dǎo)的攝入也非常少。因此，要通過(guò)B細(xì)胞表面特定的受體介

2、導(dǎo)特異性抗原攝入并誘發(fā)免疫應(yīng)答的確存在困難。
　　 越來(lái)越多的研究已經(jīng)證實(shí)B細(xì)胞完全具備作為抗原提呈細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的潛能。在缺乏其他APC成分的情況下，抗原特異的B細(xì)胞能誘導(dǎo)初始CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答；記憶性B細(xì)胞能作為APC通過(guò)CD40L-CD40依賴(lài)的方式激活初始CD4+T細(xì)胞。體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CD40活化的人B細(xì)胞可以很好地誘導(dǎo)抗原特異的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，實(shí)際上，CD40活化的人B細(xì)胞可以表達(dá)共刺激分子配體、

3、MHCⅠ類(lèi)和Ⅱ分子，并具備向次級(jí)淋巴器官遷移的能力，這些結(jié)果提示B細(xì)胞在體內(nèi)足以誘導(dǎo)初始CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答。更為重要的是，從外周血細(xì)胞中可以大量擴(kuò)增這種B細(xì)胞，使得其在疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用極具前景。
　　 抗原提呈細(xì)胞的活化狀態(tài)決定了T細(xì)胞免疫應(yīng)答的質(zhì)量和效率。靜息APC導(dǎo)致T細(xì)胞免疫耐受和無(wú)能，而充分活化的APC則自主地觸發(fā)高效的T細(xì)胞應(yīng)答。鑒于TLR9結(jié)構(gòu)性地表達(dá)在B細(xì)胞表面，采用TLR9激動(dòng)劑CpG ODN活化B細(xì)胞研究其AP

4、C的潛能已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。CpG ODN可以有效地誘導(dǎo)抗原刺激的初始B細(xì)胞增殖并延長(zhǎng)其存活時(shí)間，并促進(jìn)B細(xì)胞共刺激分子CD80、CD86及MHCⅠ、Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)，提示CpG具有增強(qiáng)初始B細(xì)胞抗原提呈的能力。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，CpG ODN活化的初始B細(xì)胞能增強(qiáng)向自體CD8+T細(xì)胞交叉提呈巨細(xì)胞病毒抗原，并誘導(dǎo)CMV特異性CD8+T細(xì)胞增殖，顯示出初始B細(xì)胞作為APC的潛能。
　　 鑒于目前關(guān)于CpG ODN在B細(xì)胞提呈HBV抗

5、原中的作用尚未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道，本研究主要觀察CpG ODN對(duì)人初始B細(xì)胞提呈HBV表位功能的影響。本研究分為兩部分。首先，我們選取三種類(lèi)型中具有代表性的ODN：CpG-2006、CpG-2216和CpG-2395，并根據(jù)我國(guó)HLA分型特點(diǎn)以及T細(xì)胞表位的親和力，選取四種不同的HLA-A2限制性HBV表位進(jìn)行試驗(yàn)；并根據(jù)前一部分結(jié)果，選取CpG-2216進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，觀察了阻斷共抑制分子PD-1/PD-L1通路對(duì)CpG-2216在B細(xì)胞提呈

6、HBV抗原中作用的影響。
　　 第一部分：CpG ODN預(yù)處理對(duì)人初始B細(xì)胞向CD8+T細(xì)胞提呈HBV表位的影響
　　 首先將CpG ODN與經(jīng)磁珠分選獲得的人初始B細(xì)胞共孵育48小時(shí)，再與HBV表位共孵育12h后進(jìn)行熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示，CpG不同程度地增強(qiáng)初始B細(xì)胞與HBV表位的結(jié)合(p<0.01)，其中初始B細(xì)胞結(jié)合表位HBx115-123增強(qiáng)最顯著。隨后，我們檢測(cè)了CpG ODN活化的初始B細(xì)胞與

7、表位結(jié)合后的共刺激分子CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ分子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CpG ODN不同程度地上調(diào)了上述共刺激分子和MHC分子的表達(dá)，提示CpG ODN活化的初始B細(xì)胞具有APC潛能。通過(guò)將與表位結(jié)合的CpG ODN活化后的初始B細(xì)胞與自體CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)：CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和顆粒酶B的水平不同程度地上調(diào)，其中與表位HBx115-123結(jié)合的CpG-2216活化的初始B細(xì)胞誘導(dǎo)的上調(diào)最顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)

8、果提示：CpG ODN可差異性地增強(qiáng)初始B細(xì)胞向自體CD8+T細(xì)胞提呈HBV表位的能力。
　　 第二部分：阻斷人初始B細(xì)胞PD-1/PD-L1通路對(duì)CpG ODN增強(qiáng)其抗原遞呈功能的影響
　　 我們采用單克隆抗體阻斷初始B細(xì)胞PD-1/PD-L1通路之后向自體CD8+T細(xì)胞提呈HBV表位HBx115-123，并檢測(cè)了HBx115-123特異性CTLs的數(shù)量及CD8+T細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)。結(jié)果顯示：采用PD-L1的阻斷性

9、抗體阻斷PD-1/PD-L1通路，能使表位特異性CTL數(shù)量顯著增加，并使CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平顯著增高。同時(shí)采取CpG-2216活化及阻斷PD-1/PD-L1通路，與單獨(dú)應(yīng)用二者之一比較，初始B細(xì)胞誘導(dǎo)上述效應(yīng)的能力顯著提高(p<0.01)。
　　 綜上所述，本研究結(jié)果提示：CpG ODN能差異性地提高人初始B細(xì)胞對(duì)HBV表位的抗原提呈功能，并能有效增強(qiáng)其誘導(dǎo)的自體CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用；聯(lián)合阻斷人初始B細(xì)胞PD