OLA1作為整合應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控因子對(duì)腫瘤生長轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的：
　　Weinberg等提出了腫瘤的幾個(gè)標(biāo)志性特征:自給自足的生長信號(hào)，抗增長抑制和細(xì)胞死亡的能力，血管生成和無限制自我復(fù)制能力，侵襲和轉(zhuǎn)移能力，逃避免疫殺傷，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，細(xì)胞能量異動(dòng)以及基因組的不穩(wěn)定性和突變性。事實(shí)上，腫瘤細(xì)胞生存在一個(gè)動(dòng)態(tài)變化中的微環(huán)境里面。腫瘤的快速生長能力會(huì)誘導(dǎo)大量的細(xì)胞內(nèi)來源或者細(xì)胞外來源的壓力的產(chǎn)生。當(dāng)腫瘤的生長速度超過血液供應(yīng)速度的時(shí)候，就會(huì)出現(xiàn)養(yǎng)料和氧氣匱乏的現(xiàn)狀。雖然腫瘤細(xì)胞對(duì)此具有一定

2、的耐受能力，但細(xì)胞內(nèi)的能量代謝會(huì)受到抑制，細(xì)胞可能因此死亡。缺氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)DNA降解，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡的出現(xiàn)。應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)會(huì)激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷，持續(xù)性蛋白質(zhì)合成的抑制會(huì)造成細(xì)胞的生長停滯。一般情況下，癌細(xì)胞是處在氧化應(yīng)激環(huán)境下。過量的活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生會(huì)引起細(xì)胞死亡。面對(duì)如此之多的各種不利的內(nèi)外壓力，腫瘤細(xì)胞已經(jīng)形成了一套稱之為整合應(yīng)激反應(yīng)(ISR)的應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)。真核生物翻譯起始

3、因子2α(eIF2α)在整合應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。eIF2a的磷酸化會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成，但同時(shí)也會(huì)增強(qiáng)了一些特殊蛋白的翻譯，如活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)。ATF4表達(dá)的上調(diào)將開啟整合應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)中一系列基因的轉(zhuǎn)錄程序。比如天冬酰胺合成酶(ASNS)和轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)。整合應(yīng)激反應(yīng)有助于腫瘤細(xì)胞耐受各種壓力環(huán)境。與此同時(shí)，整合應(yīng)激反應(yīng)的持續(xù)活化又可以通過蛋白質(zhì)合成的抑制和細(xì)胞凋亡的激活造成細(xì)胞死亡。
　　OLA

4、1，Obg like ATPase1，被認(rèn)為在細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯和降解過程中發(fā)揮調(diào)控作用。但是，對(duì)其功能和相關(guān)機(jī)制的認(rèn)知甚少。在本文里面，我們提出OLA1是作為整合應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)新的調(diào)控因子，OLA1的表達(dá)對(duì)乳腺癌的發(fā)展具有重要作用。
　　方法和結(jié)果：
　　本位主要以乳腺癌細(xì)胞系231-D3H2-LN(MDA-MB-231-luc-D3H2LN)作為對(duì)象研究了OLA1蛋白對(duì)腫瘤生長轉(zhuǎn)移能力的影響以及OLA1在整合應(yīng)激反應(yīng)(ISR

5、)中的調(diào)控作用。研究內(nèi)容主要包括三個(gè)部分:（一）OLA1對(duì)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長轉(zhuǎn)移的影響;（二）體外實(shí)驗(yàn)研究OLA1對(duì)細(xì)胞壓力應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控以及OLA1的下游調(diào)控蛋白;（三）OLA1作為乳腺癌的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)的可行性研究。
　?。ㄒ唬㎡LA1對(duì)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長轉(zhuǎn)移的影響
　　利用慢病毒感染構(gòu)建231-D3H2-LN OLA1表達(dá)敲低的穩(wěn)定細(xì)胞株以及對(duì)照組。將細(xì)胞等量注射到裸鼠脂肪墊。三周后， OLA1敲低表達(dá)腫瘤組生長速度明顯快于

6、對(duì)照組。有趣的是，體外實(shí)驗(yàn)表明OLA1對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的影響是很小的。第二次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)赟CID小鼠的脂肪墊上接種231-D3H2-LN穩(wěn)定細(xì)胞株。IVIS（體內(nèi)成像系統(tǒng)）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OLA1敲低組中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率為84.6％(11/13)，超過了對(duì)照組的38.5％(5/13)。組織病理學(xué)研究進(jìn)一步確認(rèn)小鼠淋巴結(jié)和肺的轉(zhuǎn)移情況。我們發(fā)現(xiàn)，OLA1低表達(dá)組中發(fā)生了更多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(20個(gè)，對(duì)照組9個(gè))和肺轉(zhuǎn)移（6例，對(duì)照組2例）。OL

7、A1表達(dá)的下調(diào)會(huì)增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移能力。Western blot研究腫瘤組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)在OLA1敲低腫瘤中，p-GSK-3β，p-p70S6K，p-eIF2α，ASNS和CHOP的表達(dá)下調(diào)。免疫組化染色證實(shí)了OLA1的下調(diào)會(huì)引起CHOP表達(dá)的降低以及細(xì)胞凋亡的減少。Ki67染色結(jié)果則顯示， OLA1的表達(dá)與對(duì)細(xì)胞增殖沒有影響。OLA1的抑制對(duì)乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，同時(shí)會(huì)影響腫瘤ISR通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

8、。
　?。ǘw外實(shí)驗(yàn)研究OLA1對(duì)細(xì)胞壓力應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控以及相關(guān)下游調(diào)控蛋白
　　為進(jìn)一步研究OLA1對(duì)腫瘤細(xì)胞整合應(yīng)激反應(yīng)的影響，體外實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)231-D3H2-LN穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行血清饑餓處理，氨基酸饑餓處理，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)處理(tunicamycin)或氧化應(yīng)激誘導(dǎo)處理(H2O2)。相比較對(duì)照組，OLA1表達(dá)敲低組細(xì)胞更能耐受各種壓力，細(xì)胞的存活比例也更高。Western blot結(jié)果表明，血清饑餓處理72小時(shí)后

9、，OLA1低表達(dá)組中，p-eIF2α和p-GSK-3β的水平顯著降低。在氨基酸饑餓條件下，OLA1敲低組中GCN2-p-eIF2α-ATF4表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。同樣的，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或氧化應(yīng)激條件下，OLA1低表達(dá)組里面觀察到下調(diào)的PERK-p-eIF2α-ATF4-ANSN。35S標(biāo)記方法是用來檢測(cè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的翻譯速率。在血清饑餓或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，OLA1敲低231-D3H2-LN細(xì)胞株中蛋白合成水平顯著增高。以上結(jié)果表明，OL

10、A1的抑制會(huì)降低乳腺腫瘤細(xì)胞整合應(yīng)激反應(yīng)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)并增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞在壓力條件下的生存能力。OLA1-rescue實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)觀點(diǎn)。在OLA1敲低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株中，我們利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法將OLA1表達(dá)上調(diào)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OLA1表達(dá)的回升同時(shí)伴隨著整合應(yīng)激反應(yīng)通路中PERK-eIF2α-ATF4表達(dá)的上調(diào)。在進(jìn)一步的免疫共沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，OLA1與eIF2α蛋白之間具有直接的相互作用。
　　（三）OLA1作

11、為乳腺癌的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)的可行性研究
　　采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)160例乳腺癌臨床標(biāo)本進(jìn)行了OLA1蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)，結(jié)合臨床病理資料及隨訪情況分析。Kaplan-Meier生存曲線表明，OLA1的低表達(dá)組中乳腺癌的復(fù)發(fā)時(shí)間更早（log-rank: P=0.024），乳腺癌患者術(shù)后生存更差（log-rank: P=0.033）。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析表明，OLA1的表達(dá)水平和乳腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)(HR:0.540，95％CI:0

12、.345-0.844，P=0.007)，乳腺癌患者的術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)(HR:0.514，95％CI:0.292-0.905，P=0.021)均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。OLA1的低表達(dá)預(yù)測(cè)預(yù)后不良的乳腺癌患者。
　　結(jié)論：
　　截止到現(xiàn)今，關(guān)于OLA1機(jī)制的研究少之又少，其中多數(shù)集中在原核生物中。實(shí)際上，OLA1的表達(dá)對(duì)真核生物，對(duì)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部各種機(jī)理的調(diào)控是極為重要的。OLA1不僅會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)蛋白合成，還會(huì)調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)整合應(yīng)激反應(yīng)(

13、ISR)信號(hào)通路的改變。
　　1.本文第一次提出了OLA1作為腫瘤細(xì)胞整合應(yīng)激反應(yīng)的潛在的一個(gè)調(diào)控因子。OLA1的敲低會(huì)引起腫瘤細(xì)胞中ISR通路中相關(guān)蛋白的下調(diào)，同時(shí)提高細(xì)胞對(duì)體外各種壓力刺激的耐受能力和生存能力。進(jìn)一步的，細(xì)胞內(nèi)OLA1和eIF2α蛋白是直接互相結(jié)合的，提示了OLA1是如何影響ISR通路的變化。
　　2.本文第一次檢測(cè)了OLA1對(duì)乳腺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生存和轉(zhuǎn)移能力的影響。OLA1對(duì)腫瘤細(xì)胞在體外生長的影響不