IBDV感染在雞API5的SUMO修飾中的作用研究.pdf

1、API5是極其保守的凋亡抑制蛋白家族，廣泛表達(dá)于人多種組織中，在腫瘤細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)。API5調(diào)控E2F1依賴性的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，并能通過調(diào)節(jié)NF-κB和Erk信號通路來影響腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在禽傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus)感染DF-1細(xì)胞的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)，雞API5(chAPI5)蛋白上調(diào)表達(dá)，但作用機(jī)制尚不清楚。本研究試圖制備抗雞API5蛋白的特異性抗體，以此為基

2、礎(chǔ)進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性，并初步探究雞宿主蛋白API5的SUMO化修飾與IBDV感染相互作用的機(jī)制。
　　以DF-1細(xì)胞的cDNA作為模板，擴(kuò)增雞API5編碼區(qū)基因，并將其插入到原核表達(dá)載體PET-28a(+)中。將測序正確的PET-28a-chAPI5質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(Plyss)中，優(yōu)化表達(dá)條件使chAPI5重組蛋白以可溶性形式大量表達(dá)。以純化的chAPI5蛋白為免疫原免疫Balb/c雌鼠，制備單克隆抗體。經(jīng)過3次有

3、限稀釋篩選后，獲得2株分泌抗chAPI5蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2D5，3D8。2D5，3D8這兩株單抗腹水效價分別為4.0×105，2.0×104。Western blot檢測顯示2株單抗均能識別DF-1細(xì)胞內(nèi)源性API5蛋白;IFA分析表明這兩株單抗與3Flag-chAPI5轉(zhuǎn)染的DF-1細(xì)胞均有反應(yīng)性而與未轉(zhuǎn)染3Flag-chAPI5質(zhì)粒的DF-1細(xì)胞無反應(yīng)性。兩株單抗的亞型均為IgG1/kappa。
　　利

4、用制備的chAPI5抗體檢測內(nèi)源性雞API5蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)chAPI5存在大條帶，體內(nèi)和體外實驗顯示chAPI5蛋白能夠發(fā)生SUMO化修飾;K404是chAPI5發(fā)生SUMO3修飾的關(guān)鍵位點;K404和K474是其SUMO1修飾位點;同時我們的研究還發(fā)現(xiàn)chAPI5的SUMO化修飾對其在亞細(xì)胞內(nèi)的定位有著重要的影響，野生型的chAPI5主要定位于胞核，而chAPI5K404R向胞漿聚集。
　　chAPI5mRNA在雞的不同組

5、織器官中廣泛表達(dá)，但相對轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯的差異。不過，雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)感染后，雞法氏囊組織中chAPI5mRNA和蛋白顯著上調(diào)表達(dá)，且具有一定的時間依賴性;令驚喜的是，IBDV感染上調(diào)本底chAPI5蛋白表達(dá)的同時抑制了其SUMO化修飾水平，且隨著感染時間的延長甚至完全抑制了其SUMO化修飾。此外，研究還發(fā)現(xiàn)chAPI5與IBDV-VP3蛋白可發(fā)生直接結(jié)合，并且IBDV-VP3是通過CC3結(jié)構(gòu)域與雞API5發(fā)生相互作用的。