siRNA介導的ClC-3基因沉默對H2O2誘導的PC-12細胞凋亡的影響.pdf

1、目的:觀察小干擾 RNA( small interfering RNA, siRNA)抑制氯離子通道蛋白3(voltage-dependent Cl channels-3, ClC-3)基因表達對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(rat pheochromocytoma cells, PC-12)細胞凋亡的影響,探討ClC-3在過氧化氫(H2O2)誘導的PC-12凋亡中的作用機制。
　　方法:(1)PC-12細胞的傳代培養(yǎng)。(2)細胞計數(shù)

2、(Cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒檢測不同濃度H2O2干預12h后,PC-12細胞生存率,確定構建細胞凋亡模型所需H2O2的濃度。(3)采用處于對數(shù)生長期的PC-12細胞,隨機分4組:正常對照組、模型組、空質粒組、RNA干擾組,每組設6個復孔。其中正常對照組加高糖DMEM完全培養(yǎng)基;模型組加入H2O2干預;空質粒組為轉染空質粒后加H2O2干預;RNA干擾組為轉染干擾質粒后加 H2O2干預。作用12小時后, CC

3、K-8檢測細胞生存率;Hochest33342染色細胞形態(tài)學觀察;Western Blot法檢測Caspase-3以及ClC-3蛋白的表達;實時熒光定量PCR檢測Caspase-3及ClC-3mRNA的表達;流式細胞儀(Flow cytomet,FCM)進行細胞凋亡率的檢測。
　　結果:(1)與0nmol/L模型組比較,50、100、200、300、400、500、600、700nmol/L模型組PC-12生存率降低(P<0.05

4、),且與H2O2濃度呈負相關(r=-0.961, P<0.05)。其中400nmol/L模型組細胞生存率為(49±1.20)％,采用此濃度建立 PC-12細胞凋亡的模型。(2)Hochest33342對細胞核染色顯示,與正常對照組比較,模型組、空質粒組、RNA干擾組細胞生存率降低,凋亡率增高(P<0.05)。與模型組比較,空質粒組細胞生存率、凋亡率無顯著變化(P>0.05),RNA干擾組細胞生存率增高,凋亡率降低( P<0.05)。與空

5、質粒組比較, RNA干擾組細胞生存率增高,凋亡率降低(P<0.05)。(3)Western blot結果顯示,與正常對照組比較,模型組和空質粒組細胞Caspase-3和ClC-3蛋白表達增高;RNA干擾組細胞Caspase-3和ClC-3蛋白表達降低(P<0.05)。與模型組比較,空質粒組細胞Caspase-3和ClC-3蛋白表達無顯著差異(P>0.05);與空質粒組比較,RNA干擾組細胞Caspase-3和ClC-3蛋白表達降低(P<

6、0.05)。(4)real-time PCR實驗結果顯示,與正常對照組比較,模型和空質粒組細胞Caspase-3和ClC-3mRNA表達增高;RNA干擾組細胞Caspase-3和ClC-3mRNA表達降低(P<0.05)。與模型組比較,空質粒組細胞Caspase-3和ClC-3mRNA的表達無顯著差異(P>0.05);與空質粒組比較,RNA干擾組細胞Caspase-3和ClC-3mRNA的表達降低(P<0.05)。(5)流式細胞技術顯示

7、;與正常對照組比較,模型組和空質粒組細胞凋亡率顯著增高(P<0.05)。與模型組比較,空質粒組細胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)。與空質粒組比較,RNA干擾組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。
　　結論:(1)H2O2可通過提高Caspase-3表達,激活凋亡信號通路,誘導PC-12發(fā)生凋亡。(2)沉默ClC-3基因,減少ClC-3表達,抑制caspase-3介導的凋亡通路,會減少H2O2誘導的PC-12凋亡發(fā)生,說明ClC-