納米珍珠層人工骨的制備及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、珍珠層（nacre or mother of pearl）是軟體動(dòng)物珍珠貝科或蚌科動(dòng)物的貝殼內(nèi)層部分，其主要成分為文石型碳酸鈣，并含有少量有機(jī)質(zhì)和微量金屬元素。1992年法國(guó)科學(xué)家Lopez首先在研究中發(fā)現(xiàn)珍珠層具有誘導(dǎo)成骨的作用。此后，大量研究均證實(shí)這種天然生物材料具有良好的生物相容性，并且具有骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)作用。學(xué)者們認(rèn)為珍珠層的骨誘導(dǎo)作用來(lái)自于其中的有機(jī)質(zhì)成分，其中全部或部分成分可能是具有骨誘導(dǎo)作用的信號(hào)分子。于是，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展

2、了廣泛的、將珍珠層單一材料或以其為原材料制備的復(fù)合人工骨植入骨缺損部位的實(shí)驗(yàn)研究，這些包括將珍珠層塊體植入骨承重部位和將珍珠層顆粒及粉末填充骨缺損的實(shí)驗(yàn)，以及將珍珠層復(fù)合人工骨植入大段骨缺損的實(shí)驗(yàn)，這些實(shí)驗(yàn)研究均顯示出來(lái)源于這種天然材料良好的成骨效果。 理想的骨組織植入修復(fù)材料應(yīng)具有良好的生物相容性，具有足夠的強(qiáng)度，能有效充當(dāng)新骨形成的支架，具骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)作用進(jìn)而能有效促進(jìn)骨形成，并能在體內(nèi)逐漸發(fā)生生物降解，被骨組織替代，以達(dá)

3、到完全修復(fù)的目的。隨著對(duì)珍珠層材料研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)這種材料雖然具有良好的生物學(xué)活性，其降解卻是一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)期的過(guò)程。經(jīng)研究分析，這主要與珍珠層材料的理化成分及形態(tài)大小兩種因素有關(guān)。一方面，碳酸鈣鹽在植入?yún)^(qū)域形成了弱堿性的環(huán)境，不利于材料的降解吸收；另一方面，當(dāng)珍珠層的形態(tài)逐漸變小，由塊狀、顆粒狀再到粉末狀，其降解吸收則呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。通過(guò)各種研究，人們發(fā)現(xiàn)，珍珠層這種天然材料的生物降解主要是建立在非特異性的理化溶解方式上，而活性細(xì)胞

4、介導(dǎo)的吸收方式對(duì)于這種材料的降解作用有限。 如何改善這種材料的降解性能，使之能夠更好地發(fā)揮骨修復(fù)作用，并被宿主新生骨順利的長(zhǎng)入替代，是當(dāng)前在這方面研究所面臨的最主要問(wèn)題。引起我們注意的是，目前國(guó)內(nèi)外進(jìn)行廣泛的實(shí)驗(yàn)研究所采用的珍珠層粉，均是屬于微米級(jí)的粉體，由此可知其內(nèi)部文石晶片和有機(jī)質(zhì)沒(méi)有發(fā)生完全解離，被認(rèn)為這是影響其降解的主要原因之一。如前所述，由于珍珠層的降解方式主要是建立在非特異性的理化溶解方式上的，可以認(rèn)為隨著珍珠層的粒

5、度進(jìn)一步下降，將會(huì)更有利于其降解。 隨著材料學(xué)的不斷發(fā)展，應(yīng)用納米技術(shù)制備的生物活性材制-納米人工骨也隨之誕生，這種新材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與天然骨相似，有助于體內(nèi)的細(xì)胞及大分子對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，從而使得材料的生物活性、利用度和生物相容性得以提高。經(jīng)過(guò)初步的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，納米材料具有良好的生物相容性及骨引導(dǎo)活性，其生物活性優(yōu)于微米材料。同時(shí)，由于納米材料中的納米粒子所具有的量子尺寸效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)的特點(diǎn)，其降解性

6、能也因此而得到了提高。 本實(shí)驗(yàn)研究是在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，將機(jī)械研磨法獲得的納米珍珠層粉與消旋聚乳酸，采用與以往相同的制備工藝，即溶劑澆鑄、熱壓鑄模、溶質(zhì)瀝濾的工序，復(fù)合成多孔結(jié)構(gòu)的納米級(jí)珍珠層粉/消旋聚乳酸復(fù)合人工骨，由于機(jī)械研磨法制得的納米珍珠層粉具有保留其原有活性成分的效果，并且其產(chǎn)生的弱堿性的環(huán)境與消旋聚乳酸降解后的弱酸性產(chǎn)物發(fā)生中和，從理論上分析將有利于這種新材料的降解吸收；將納米級(jí)珍珠層粉／消旋聚乳酸復(fù)合人工骨

7、與以往的微米級(jí)珍珠層粉／消旋聚乳酸復(fù)合人工骨進(jìn)行比較研究，從材料表征和理化特性、體外細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)以及動(dòng)物體內(nèi)植入試驗(yàn)等各個(gè)方面進(jìn)行全面分析，旨在探討這一新型天然納米材料納米珍珠層粉，與人工合成高分子生物材料消旋聚乳酸相結(jié)合，所制作的復(fù)合人工骨的生物學(xué)效應(yīng)和生物降解能力，為其推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的： 1.探討納米珍珠層人工骨與微米珍珠層人工骨相比之下的性能變化及其應(yīng)用的合理性； 2.研究納米珍珠層人工骨與成骨細(xì)

8、胞的生物相容性； 3.觀察納米級(jí)珍珠層粉在大鼠骨缺損區(qū)的降解吸收情況和以其為原材料制作的復(fù)合人工骨在大鼠體內(nèi)的生物相容性； 4.觀察納米珍珠層人工骨修復(fù)兔橈骨缺損的作用。 方法： 1.材料制備：采用機(jī)械研磨法獲得納米級(jí)珍珠層粉，與消旋聚乳酸復(fù)合，按照溶劑澆鑄、熱壓鑄模、溶質(zhì)瀝濾的工序，制成中空?qǐng)A柱體的納米級(jí)珍珠層粉/消旋聚乳酸復(fù)合人工骨，同法制作出實(shí)心圓柱體的微米級(jí)珍珠層粉/消旋聚乳酸復(fù)合人工骨。

9、 2.材料表征測(cè)定：通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察納米級(jí)珍珠層粉與微米級(jí)珍珠層粉的實(shí)際粒徑、以及這兩種原材料制得的納米珍珠層復(fù)合人工骨和微米珍珠層復(fù)合人工骨的孔徑，采用比重法測(cè)量?jī)煞N人工骨的孔隙率，并采用MTS858萬(wàn)能力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)對(duì)這兩種人工骨進(jìn)行生物力學(xué)強(qiáng)度的檢測(cè)，對(duì)以上檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。 3.體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)：納米珍珠層/消旋聚乳酸復(fù)合人工骨與微米珍珠層／消旋聚乳酸復(fù)合人工骨分別與傳至第3代的成骨細(xì)胞共培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下觀察

10、成骨細(xì)胞貼附情況，在掃描電子顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞在材料上生長(zhǎng)情況，用CCK-8法檢測(cè)成骨細(xì)胞與人工骨材料共培養(yǎng)1、3、5、7天后的增殖情況，共培養(yǎng)7天后，BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白含量，AKP試劑盒測(cè)定細(xì)胞堿性磷酸酶活性。 4.原材料粉體及人工骨片體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)：將納米珍珠層粉及其與消旋聚乳酸復(fù)合制得的人工骨片，分別植入大鼠股骨骨洞及股部肌囊，同時(shí)與微米珍珠層粉及其復(fù)合人工骨作對(duì)照，并建立空白對(duì)照。于術(shù)后當(dāng)天及第2、4、8周分別作X-r

11、ay攝片檢查，動(dòng)物處死前予四環(huán)素注射作活體熒光標(biāo)記，處死后行大體、組織學(xué)及掃描電鏡觀察。 5.人工骨植入體內(nèi)修復(fù)大段骨缺損實(shí)驗(yàn)：將納米珍珠層/消旋聚乳酸復(fù)合人工骨植入新西蘭白兔1.5cm的橈骨缺損區(qū)，同時(shí)與微米珍珠層／消旋聚乳酸復(fù)合人工骨作對(duì)照，并設(shè)立空白對(duì)照。分別于術(shù)后當(dāng)天及4、8、16、24周作X線、骨密度測(cè)量，動(dòng)物處死前予四環(huán)素注射作活體熒光標(biāo)記，然后動(dòng)物取材作大體及組織學(xué)檢查。 結(jié)論： 1.納米珍珠層人工

12、骨的制備原料納米珍珠層粉采用機(jī)械球磨法制作，其粉體粒徑達(dá)到納米級(jí)顆粒的要求。納米珍珠層／消旋聚乳酸復(fù)合人工骨具有良好的孔徑及孔隙率，其生物力學(xué)特性達(dá)到了人工骨植入的性能指標(biāo)要求。 2.帶有中空孔道的納米珍珠層／消旋聚乳酸復(fù)合人工骨在制備上更為合理，這種結(jié)構(gòu)可以有效避免發(fā)生溶質(zhì)濾出不徹底的問(wèn)題。中空體的納米珍珠層／消旋聚乳酸復(fù)合人工骨可增加人工骨材料與植入部位內(nèi)環(huán)境的接觸面，有利于內(nèi)部物質(zhì)的交換，并且在必要時(shí)還可以作為促骨生長(zhǎng)因子

13、以及藥物的承載空間。 3.納米珍珠層／消旋聚乳酸復(fù)合人工骨屬于一種無(wú)細(xì)胞毒性的納米材料，具有良好的生物相容性，對(duì)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖與分化功能無(wú)不良影響，并且在一定程度上促進(jìn)了成骨細(xì)胞的功能，利于細(xì)胞的粘附與生長(zhǎng)；同時(shí)，這種復(fù)合人工骨還具有良好的骨傳導(dǎo)功能。 4.納米珍珠層粉較微米珍珠層粉在體內(nèi)具有更好的生物降解性能，這種材料的生物降解作用主要是發(fā)生在非特異性理化溶解的方式之上的。并且，納米珍珠層粉的誘導(dǎo)成骨、促進(jìn)骨組織