緩釋PDGF-BB的納米珍珠層-聚乳酸-纖維蛋白膠復(fù)合支架的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 創(chuàng)傷、腫瘤切除以及感染等多種原因均可導(dǎo)致骨缺損。骨缺損修復(fù)一直是臨床骨科醫(yī)師所面臨的一項難題。目前，臨床上常用的修復(fù)方法，如自體骨移植、異體骨移植均存在不足之處，難以滿足臨床上治療的需要。隨著骨組織工程技術(shù)的興起和快速發(fā)展為骨缺損的修復(fù)重建提供了嶄新的思路。
　　 珍珠層是軟體動物珍珠貝科或蚌科動物的貝殼內(nèi)層部分，一般由95％的文石型CaCO3晶體和5％的有機質(zhì)組成，是一種天然的無機有機層狀生物復(fù)和材料

2、。珍珠層中的有機質(zhì)主要含有蛋白和多糖等大分子物質(zhì)。研究表明，珍珠層作為生物替代材料具有其它無機材料無法比擬的優(yōu)勢，它是一種來源于生物體的材料，來源豐富，成本低廉，加工簡易，理化性質(zhì)及生物學(xué)特性與動物及人類骨組織非常接近。法國科學(xué)家Lopez等首次在體外研究證實珍珠層具有誘導(dǎo)造骨細胞活化成骨的作用，其后相關(guān)的研究證實珍珠層是一種新型的可降解生物活性材料，它不僅具有很好的生物相容性，而且同時具有骨傳導(dǎo)作用和潛在骨誘導(dǎo)性，與現(xiàn)有的臨床所用的各

3、種骨植入材料相比具有無比的優(yōu)越性，是一種很有前途的骨植入材料。
　　 隨著人們對支架材料性能要求的進一步提高，單相的生物支架材料已經(jīng)難以滿足臨床的要求，因而將不同性質(zhì)的材料進行復(fù)合以獲取優(yōu)良臨床性能的復(fù)合生物材料已經(jīng)成為當前材料領(lǐng)域研究的熱點。有機高分子聚合物材料聚乳酸(Poly-lactideacid，PLA)，具有良好的生物相容性、可降解吸收性，聚乳酸作為新型生物可降解材料在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面占據(jù)著重要地位。其中，消旋聚乳酸(

4、Poly-D，L-lactideacid,PDLLA)降解和吸收速度較快，更適宜選作骨替代材料。盡管聚乳酸具備諸多優(yōu)點，但它存在高疏水性、細胞親和性差、機械強度不足和產(chǎn)物易引起炎癥反應(yīng)等缺點使其應(yīng)用受限。由于珍珠層的主要成分是CaCO3晶體，具有一定的堿性、力學(xué)性能較好，與聚乳酸復(fù)合可彌補各自的缺點。因此，本課題組早期采用自行設(shè)計的“模壓增強法”專利技術(shù)制作珍珠層/聚乳酸復(fù)合人工骨。經(jīng)過一系列的體內(nèi)外研究，均證實了這種復(fù)合材料具有良好的

5、生物相容性和成骨能力;與此同時，我們也發(fā)現(xiàn)珍珠層的生物降解緩慢，降解速度與新生骨的生長速度不成比例。
　　 近年來人們對納米材料的研究，取得了廣泛的進展。為此，本著如何改善珍珠層人工骨降解性能和保持其生物學(xué)活性的目的，本課題組試圖探討納米珍珠層人工骨在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用。我們利用行星式球磨機制備納米級珍珠層粉，然后將納米級珍珠層粉與消旋聚乳酸復(fù)合，按照溶劑澆鑄、熱壓鑄模、溶質(zhì)瀝濾的工序，制成納米珍珠層人工骨，初步研究表明納米珍珠層人

6、工骨原材料粒徑小，有利于降解吸收，并具有良好的生物相容性及生物活性。由于納米珍珠層與消旋聚乳酸混合制備人工骨材料，總體上降低了珍珠層的含量，從而降低了人工骨的潛在骨誘導(dǎo)性;加上我們課題組系列前期研究證實PDGF-BB可以加速骨缺損的修復(fù)，同時促進破骨細胞的骨吸收功能，在調(diào)節(jié)骨組織改建中發(fā)揮重要作用。因此，我們在改善復(fù)合支架材料理化性能的基礎(chǔ)上嘗試將PDGF-BB與納米珍珠層/聚乳酸支架復(fù)合，增強其骨誘導(dǎo)性，從而促進其修復(fù)骨缺損的能力。<

7、br>　　 本實驗研究是在上述仿生的思路下和本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，采用粒子瀝濾-模壓成型-冷凍干燥技術(shù)制備緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架，并對支架的理化性能、力學(xué)性能、生物相容性和成骨能力進行綜合評價，為新材料的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　 目的:
　　 1.探討緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架的制備方法及其性能;
　　 2.觀察緩釋PDGF-BB的納米

8、珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架材料對MC3T3-E1粘附、增殖及分化等生物行為的影響;
　　 3.探討緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架材料的動物體內(nèi)生物相容性和使用安全性;
　　 4.探索將緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架植入兔橈骨15mm臨界性骨缺損，觀察其體內(nèi)成骨情況及修復(fù)骨缺損的效果。
　　 方法:
　　 1.緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚

9、乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架的制備及表征
　　 (1)納米珍珠層粉的制備以海水珍珠層粉為原料，利用行星式球磨機制備納米級珍珠層粉，對所得珍珠層粉采用超高分辨率場發(fā)射掃描電子顯微鏡進行檢測和X射線衍射分析。
　　 (2)緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架的制備采用溶劑澆鑄-粒子瀝濾法制備聚乳酸支架（S1支架）和納米珍珠層/聚乳酸支架（S2支架），接著將PDGF-BB與纖維蛋白膠混合注入S2支架，冷凍干燥

10、后制成緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架(S3支架)。三種支架通過萬能測試機測試抗壓強度、掃描電子顯微鏡觀察表面形貌以及阿基米德法測定孔隙率，對以上檢測結(jié)果進行對比分析;利用ELISA法檢測S3支架降解過程中PDGF-BB釋放量。
　　 2.緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架的細胞相容性將MC3T3-E1細胞分別接種聚乳酸支架（S1支架組）、納米珍珠層/聚乳酸支架（S2支架組）和緩

11、釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架（S3支架組），單純細胞培養(yǎng)為空白對照組。在倒置相差顯微鏡下觀察MC3T3-E1細胞貼附情況，在掃描電子顯微鏡下觀察MC3T3-E1細胞在材料上生長情況，沉淀法和MTT法檢測MC3T3-E1細胞的粘附和增殖情況，堿性磷酸酶試劑盒測定細胞堿性磷酸酶活性變化，茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色觀察MC3T3-E1細胞礦化能力的變化。
　　 3.緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)

12、合支架的組織相容性
　　 (1)將制備好的緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架放入生理鹽水中獲取材料浸取液，然后進行急性全身毒性試驗、皮內(nèi)刺激試驗以及熱原實驗。
　　 (2)動物體內(nèi)筋膜下植入試驗:取新西蘭大白兔12只，在兔皮下筋膜組織中植入聚乳酸支架（S1支架組）、納米珍珠層/聚乳酸支架（S2支架組）和緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架（S3支架組）。分別于術(shù)后1、4、8、

13、12周分別行X-ray檢查，取材后行HE染色、光學(xué)顯微鏡下觀察組織反應(yīng)情況。
　　 4.緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架的成骨能力
　　 (1)實驗分組體重2～3kg的成年雄性新西蘭大白兔36只，隨機分為4組，兩側(cè)橈骨制造15mm骨缺損。分別植入聚乳酸支架（S1支架組），納米珍珠層/聚乳酸支架（S2支架組）和緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架（S3支架組），不植入支架材料

14、的為空白對照組。
　　 (2)兔橈骨臨界性骨缺損模型的建立手術(shù)過程:動物麻醉后，備皮、消毒、鋪巾，沿橈骨干長軸方向切開皮膚、皮下組織、深筋膜，鈍性分離肌肉，骨膜剝離器剝離骨膜，暴露橈骨中段，手持式電動擺鋸截取兔雙側(cè)橈骨中段，造成約15mm骨和骨膜節(jié)段性骨缺損模型，按組別分別將各組支架材料放置于骨缺損部位。
　　 (3)取材及觀察指標
　　 在植入支架材料后4，8，12周觀察各組實驗動物飲食、活動及傷口愈合等大體情

15、況，以及骨缺損部位X射線變化，并取材行大體觀察、Micro-CT掃描重建、骨密度測量和組織學(xué)觀察。
　　 結(jié)果:
　　 1.X射線衍射分析結(jié)果表明所選樣品96％為文石型CaCO3，平均粒度為70.3nm。超高分辨率場發(fā)射掃描電子顯微鏡測試表明珍珠層粉中的文石顆粒粒徑45-95nm，顆粒大小不等，存在團聚現(xiàn)象。成功制得S1支架，S2支架和S3支架三種材料，均為3.5mm×3.5mm×15mm和8mm×8mm×15mm的實心

16、圓柱體。
　　 2.通過電鏡觀察，S1支架，S2支架和S3支架三種材料，均具有良好的三維多孔結(jié)構(gòu)，孔徑分別為(330.0±55.6)μm、(322.5±50.8)μm和(303.3±47.0)μm，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.141）;采用阿基米德法測定孔隙率分別為81.0±1.1％、82.5±0.8％和80.2±0.7％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.211);生物力學(xué)測試結(jié)果顯示抗壓強度分別為(3.6±0.12)MPa、(5.0±

17、0.35)MPa和(5.1±0.26)MPa，S1與S2和S3有顯著性差異(P＜0.001)。ELISA實驗結(jié)果表明S3支架中復(fù)合的PDGF-BB釋放長達30d，呈持續(xù)緩慢釋放。
　　 3.MC3T3-E1細胞在S3支架上能良好的粘附、增殖，并向支架孔內(nèi)生長，明顯優(yōu)于S1和S2支架。培養(yǎng)4h和24h后S3支架組細胞粘附率均顯著高于S1和S2支架組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。MTT檢測MC3T3-E1在各組中均生長良好

18、，A值均隨時間延長而增大，同組各時間點比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）;各時間點組間比較，S3支架組與其余三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。各組ALP活性在第7d時達到最高峰，各時間點細胞ALP活性表達S3組最高，與其余各組比較有顯著性差異(P＜0.001)。支架材料與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)3周后，經(jīng)茜素紅染色，可見大小不一、形態(tài)各異的紅色結(jié)節(jié)，與S1支架組、S2支架組和空白對照組相比，S3支架組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)目和面

19、積明顯增加。
　　 4.通過急性全身毒性試驗、皮內(nèi)刺激試驗、熱原試驗和動物皮下植入試驗表明，緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架材料無毒性作用，不引起皮內(nèi)刺激反應(yīng)，不具有致熱原作用，體內(nèi)植入后無明顯組織反應(yīng)，符合相應(yīng)標準要求，具有良好的生物安全性。
　　 5.一般情況:術(shù)后所有動物傷口愈合良好，未發(fā)生骨折，活動進食情況和精神狀態(tài)基本正常。X線檢查:S3支架組在術(shù)后4周時截骨端及缺損區(qū)有密度較低的骨痂

20、形成，缺損區(qū)部分為骨痂填充;術(shù)后8周時骨缺損處已有大量新生骨所填充，兩斷端間形成橋接，可見部分髓腔再通;術(shù)后12周時骨缺損處完全為新生骨橋接，密度較均一，骨缺損基本完全愈合，髓腔再通;各時間點Lane-SandhuX線評分，S3支架組均優(yōu)于S2支架組，有顯著性差異(P＜0.05);S2支架組優(yōu)于S1支架組和空白對照組，有顯著性差異（P＜0.05）。骨密度測量:各時間點S3支架組的骨密度顯著高于S1與S2支架組，有顯著性差異(P＜0.00

21、1)，12周時S3支架組的骨密度值與正常值無顯著性差異(P＞0.05)。大體標本觀察:術(shù)后12周時S3支架組材料完全被骨痂包裹，界限消失，不易分辨出骨缺損端，皮質(zhì)完全連接;S2支架組可見斷端出現(xiàn)骨性連接，修復(fù)尚不完全;S1支架組僅尺側(cè)有少量骨相連，空白對照組骨缺損清晰可見。Micro-CT掃描重建:術(shù)后12周S1支架組重建后只能看到零星的新生骨結(jié)構(gòu);S2支架組重建后可見形成的新骨結(jié)構(gòu)不規(guī)則，部分骨缺損未能修復(fù);S3支架組重建后可見形成的

22、新骨結(jié)構(gòu)連續(xù)、完整、規(guī)則，骨缺損基本完全修復(fù);空白對照組未見成骨，橈骨保持了骨缺損狀態(tài)。組織學(xué)檢查:S3支架組術(shù)后4周，骨斷端與支架材料結(jié)合部、支架材料內(nèi)部均可見少量的新生軟骨，有類骨樣組織出現(xiàn)，支架結(jié)構(gòu)較完整，可見纖維結(jié)締組織長入，并有少量血管存在;術(shù)后8周，骨缺損處新生骨組織增多，出現(xiàn)成熟的骨細胞和編織骨，支架材料部分降解，內(nèi)部有血管生成;術(shù)后12周，新生骨逐漸改建，骨斷端與材料界限不清，兩者以大量的編織骨或成熟的板層骨連接，髓腔再

23、通。
　　 結(jié)論:
　　 1.緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架材料具有高孔隙率、合適的孔徑和孔與孔之間的貫通性，其生物力學(xué)特性達到了組織工程對支架材料的性能要求，并且持續(xù)緩慢釋放PDGF-BB。
　　 2.緩釋PDGF-BB的納米珍珠層/聚乳酸/纖維蛋白膠復(fù)合支架材料屬于無細胞毒性的生物材料，具有良好的生物相容性，有利于MC3T3-E1細胞的粘附與生長，并且在一定程度上促進MC3T3-E