原花青素對(duì)高糖環(huán)境下大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞VEGFR-2及其傳導(dǎo)通路的影響.pdf

1、目的:全世界糖尿病的快速增長趨勢使21世紀(jì)人類健康問題面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。糖尿病患者的增長數(shù)量超過預(yù)期。在2007年，全世界2.46億(約6％)的人群患病，估計(jì)在2025年這個(gè)數(shù)值將達(dá)到3.8億，約占全世界人口總數(shù)的7.3％。與此同時(shí)，預(yù)計(jì)有接近3.08億的人群有糖耐量異常，這是導(dǎo)致2型糖尿病的高危因素，糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一種以高血糖，胰島素缺乏導(dǎo)致的糖耐量異常和/或胰島功能下降為特征的代謝紊亂性疾病。糖尿

2、病大血管病變一直是患者致殘致死的首要原因，30％～40％的患者在發(fā)病10年后至少會(huì)發(fā)生一種血管并發(fā)癥。大量研究顯示:DM血管并發(fā)癥與內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激密切相關(guān)，而部分內(nèi)皮細(xì)胞起源于內(nèi)皮祖細(xì)胞（主要分布于骨髓）。大量資料表明，糖尿病患者體內(nèi)高糖環(huán)境對(duì)其內(nèi)皮細(xì)胞的功能有較大的影響，與此同時(shí)，外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量也急劇下降，這提示內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能和數(shù)量與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生有很大相關(guān)性。原花青素及其低聚產(chǎn)物是存在于大多數(shù)植物中的一種抗氧化

3、劑，在漿果內(nèi)植物中含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其它植物數(shù)倍。目前為止，葡萄籽中花青素的含量是最為豐富的。本文主要研究原花青素及其低聚物在抗氧化應(yīng)激方面對(duì)EPCs的保護(hù)作用，探討高糖環(huán)境下原花青素對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的VEGFR-2及其下游相關(guān)通路的影響作用。
　　方法:將SD大鼠脫頸處死，用75％酒精浸泡20分鐘，在超凈臺(tái)下進(jìn)行股骨和脛骨的無菌分離，用無菌的含1％肝素的PBS液沖洗骨髓腔，直至沖洗液呈無色透明狀，收集所有沖洗液，并進(jìn)行高速離

4、心，移去上清液，收集離心后試管底的細(xì)胞，采用Ficoll密度梯度離心法分離大鼠骨髓單核細(xì)胞;將分離出的單核細(xì)胞接種于6孔板中，分別于3d、7d后進(jìn)行換液及在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。采用FITC-UEA-1和DiI-acLDL雙吞法鑒定EPCs。分別檢測正常糖濃度組（5.5mmol/L+25mmol/L甘露醇）培養(yǎng)和高糖濃度組(30mmol/L)培養(yǎng)的EPCs增殖和氧化應(yīng)激產(chǎn)物產(chǎn)生情況，再通過在不同原花青素濃度下檢測各時(shí)間點(diǎn)EPCs

5、增殖的方法，篩選出最佳原花青素濃度（30μg/ml）;分別用Matrigel基質(zhì)膠檢測正常糖濃度+30μg/ml OPC、正常糖濃度組、HG+30μg/ml OPC、HG組EPCs成管能力;最后在1d、3d、5d、7d分別檢測正常糖濃度+30μg/ml OPC組、正常糖濃度組、高糖濃度+30μg/ml OPC組、高糖濃度組的EPCs的MDA值以及VEGFR-2、AKT、IKB-a和NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果:接種在6孔

6、板中的細(xì)胞3d后，大部分呈圓形，細(xì)胞透亮，并逐漸開始貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)7d后，可見細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)梭形形態(tài)，最終呈現(xiàn)出“鵝卵石”形態(tài)分布。EPCs經(jīng)過DiI-ac-LDL及FITC-UEA-1處理后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞顯色，綠色熒光為經(jīng)FITC-UEA-1處理后EPCs，紅色熒光為經(jīng)DiI-ac-LDL處理后EPCs，藍(lán)色熒光為核染色，雙染陽性鑒定為正在分化的EPCs。隨時(shí)間推移，高糖濃度組中EPCs細(xì)胞凋亡和氧化

7、應(yīng)激產(chǎn)物均較正常糖濃度組逐漸增多(P＜0.05); Con+OPC、Con組EPCs成管數(shù)目無明顯差異(P＞0.05)，HG+OPC組成管數(shù)目較HG組明顯增多(P＜0.05);在1d、3d、5d、7d時(shí)OPC在正常糖濃度下對(duì)EPCs產(chǎn)生的氧化應(yīng)激產(chǎn)物及VEGFR-2、AKT、IKB-a和NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量沒有顯著影響(P＞0.05)，而在高糖環(huán)境下可以明顯降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物的生成及上調(diào)VEGFR-2、AKT和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)

8、量(P＜0.05)，下調(diào)IKB-a蛋白相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05)。
　　結(jié)論:高糖環(huán)境下EPCs增殖能力較正常糖濃度顯著降低，而且高糖組的EPCs的MDA值較正常糖濃度顯著增高，這表明高糖濃度下的EPCs產(chǎn)生了大量的氧化應(yīng)激產(chǎn)物(ROS)。氧化應(yīng)激產(chǎn)物的過量產(chǎn)生超出細(xì)胞本身清除能力進(jìn)而造成細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞增殖。原花青素及其低聚產(chǎn)物可能通過緩解高糖環(huán)境對(duì)EPCs的氧化損傷作用，上調(diào)內(nèi)皮祖細(xì)胞VEGFR-2及其下游通路蛋白表達(dá)進(jìn)而促