葡萄子原花青素對(duì)高糖條件下載脂蛋白A-Ⅰ合成及表達(dá)的影響.pdf

1、第一部分葡萄子原花青素抑制糖尿病大鼠主動(dòng)脈載脂蛋白A-I的表達(dá)
　　 背景：
　　 世界衛(wèi)生組織推測(cè)2025年成年人中糖尿病患者將達(dá)到3億。若按糖尿病患者人數(shù)計(jì)算，中國(guó)位居印度之后，排名第2位。糖尿病是老年人面臨的重大的健康、社會(huì)以及經(jīng)濟(jì)問題。糖尿病大血管病變是糖尿病患者常見的慢性并發(fā)癥，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因之一，其病理變化過(guò)程始于內(nèi)皮功能不良可發(fā)展到動(dòng)脈粥樣斑塊形成，發(fā)病機(jī)制尚不明確，但由慢性高血糖誘導(dǎo)的

2、氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是重要原因之一。葡萄子原花青素(grape seed proanthocyanidinsextracts，GSPE)是從葡萄籽中提取的多酚類混合物，其原花青素含量超過(guò)95％。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，GSPE具有抗氧化、抗動(dòng)脈硬化及保護(hù)心血管等作用。并且，GSPE對(duì)鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠并發(fā)的血管病變、心肌病變、腎臟病變及神經(jīng)病變均具備一定的保護(hù)作用。眾所周知，載脂蛋白A-I(apolip

3、oprotein A-I，apoA-I)是高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)最主要的蛋白成分。研究證明，血漿中HDL的含量與冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)性，即HDL含量越高，冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)病率越低。ApoA-I對(duì)冠狀動(dòng)脈保護(hù)作用明確。監(jiān)測(cè)GSPE對(duì)apoA-I水平的影響以及因此帶來(lái)的效應(yīng)、探討GSPE血管保護(hù)機(jī)制將有助于發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點(diǎn)，為研究新的糖尿病并發(fā)癥防治藥物提供理論依據(jù)。
　　 目的

4、：
　　 大量研究證實(shí)，葡萄子原花青素(GSPE)有強(qiáng)大的抗氧化和抗衰老功能。本實(shí)驗(yàn)觀察葡萄子原花青素對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血漿和主動(dòng)脈組織內(nèi)載脂蛋白A-I(apoA-I)的影響。
　　 方法：
　　 55只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(C組，n=15)、糖尿病組(DM組，n=20)和糖尿病GSPE治療組(DM+GSPE組，n=20)。糖尿病組和糖尿病GSPE治療組大鼠一次性尾靜脈注射0.1

5、％STZ檸檬酸緩沖液55 mg/kg，正常對(duì)照組注射同等劑量的檸檬酸緩沖液。注射72h后，取大鼠尾血測(cè)定血糖，血糖≥16.7mmol/L為糖尿病模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)DM組每天給予生理鹽水灌胃，DM+GSPE組每天給予GSPE(250mg/kg)灌胃。持續(xù)觀察24周。測(cè)定每組動(dòng)物血漿低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)和載脂蛋白A-I(apoA-I)的水平。24周后處死動(dòng)物，迅速分離胸主動(dòng)脈，并用冰磷酸鹽緩沖液徹底清洗去除血液成分

6、，之后立刻置于液氮中凍存。胸主動(dòng)脈自根部切成1cm左右的小段，在10％的甲醛中固定，石蠟包埋，切成4μm厚的切片，行蘇木素-曙紅染色，在200倍的光鏡下觀察。應(yīng)用熒光差異凝膠電泳技術(shù)觀察經(jīng)GSPE治療后糖尿病大鼠主動(dòng)脈差異表達(dá)蛋白，并應(yīng)用質(zhì)譜分析鑒定該差異蛋白點(diǎn)。鑒定后應(yīng)用Western blot和免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證經(jīng)GSPE治療后該差異蛋白apoA-I在糖尿病大鼠主動(dòng)脈中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 糖尿病組大鼠血漿LD

7、L、HDL和apoA-I水平均高于正常對(duì)照組，經(jīng)GSPE治療后LDL、HDL和apoA-I水平下降至接近正常。糖尿病組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞肥大，結(jié)構(gòu)紊亂，平滑肌細(xì)胞增生，內(nèi)彈力板破壞，管腔變小，經(jīng)GSPE治療后，上述變化均未出現(xiàn)，血管結(jié)構(gòu)接近對(duì)照組。熒光差異凝膠電泳和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠主動(dòng)脈apoA-I經(jīng)GSPE治療后差異表達(dá)(DM組/C組：-1.68；DM+GSPE組/DM組：1.77)。之后的Westernblot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)

8、該差異蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠主動(dòng)脈組織中的apoA-I水平最高(p＜0.05)，GSPE能有效地降低這種表達(dá)(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.GSPE有助于緩解糖尿病的大血管病變；
　　 2.GSPE可以調(diào)節(jié)apoA-I在主動(dòng)脈組織的表達(dá)水平，并且該調(diào)節(jié)可能是其實(shí)現(xiàn)對(duì)血管保護(hù)作用的機(jī)制之一；
　　 3.apoA-I表達(dá)數(shù)量或修飾的變化可能是糖尿病大鼠主動(dòng)脈病變發(fā)病機(jī)制之一，但仍需今

9、后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加以驗(yàn)證。
　　 第二部分葡萄子原花青素對(duì)實(shí)驗(yàn)性高糖條件下 HepG2細(xì)胞表達(dá)載脂蛋白A-I的影響
　　 背景：
　　 載脂蛋白A I(apoA-I)是高密度脂蛋白(HDL)的主要成分之一，占HDL中蛋白質(zhì)含量的50％左右，介導(dǎo)了許多重要的生理功能。它可以與血管壁上的ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體Al(ABCA1)結(jié)合，誘導(dǎo)游離膽固醇從血管內(nèi)皮中的巨噬細(xì)胞或其他表皮組織中向外流出，是誘導(dǎo)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)的

10、起始階段，隨后能激活結(jié)合于HDL的卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)，將游離膽固醇酯化，再?gòu)腍DL的表面轉(zhuǎn)移至其內(nèi)核，進(jìn)而向肝臟運(yùn)輸，是體內(nèi)逆向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵作用因子。最近研究表明，它還具有其他生化作用，包括抗氧化作用、抗炎、抗內(nèi)毒素作用等。因此，促進(jìn)apoA-I的表達(dá)有助于緩解動(dòng)脈硬化的進(jìn)程。
　　 目的：
　　 葡萄子原花青素(GSPE)是從葡萄籽中提取的天然抗氧化物質(zhì)。本研究以體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞系HepG2為研

11、究對(duì)象，分別從蛋白和基因水平觀察GSPE是否能誘導(dǎo)HepG2的apoA-I表達(dá)。
　　 方法：
　　 首先用10％滅活新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株HepG2并傳代，然后用高糖及低糖無(wú)血清培養(yǎng)基，添加不同濃度(2.5、5及10μg/ml)GSPE與HepG2細(xì)胞孵育24 h，期間用SRB測(cè)定GSPE對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，Western Blot測(cè)定細(xì)胞內(nèi)apoA-I蛋白水平，RT-PCR測(cè)定apoA-

12、I mRNA變化。觀察GSPE是否促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性高糖條件下HepG2細(xì)胞apoA-I的高表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)用高糖和低糖培養(yǎng)基孵育HepG2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用高糖培養(yǎng)基孵育的HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的apoA-I不論從蛋白還是基因水平均明顯低于用低糖培養(yǎng)基者(p＜0.05)。
　　 2.在添加GSPE與無(wú)血清高糖培養(yǎng)基共同孵育HepG2細(xì)胞時(shí)，SRB檢測(cè)細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)，GSPE濃度在20μg/ml以上時(shí)，

13、孵育4小時(shí)，即出現(xiàn)了HepG2細(xì)胞的明顯凋亡；而在GSPE濃度低于10μg/ml的各組，共同孵育24小時(shí)，HepG2細(xì)胞無(wú)明顯凋亡，細(xì)胞存活率均在70％以上，因此，實(shí)驗(yàn)最終設(shè)立了2.5、5、10μg/ml GSPE干預(yù)組作為觀察對(duì)象。
　　 3.經(jīng)GSPE孵育后，不論從基因還是蛋白水平，HepG2細(xì)胞表達(dá)apoA-I均較單純高糖孵育增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，且該種促進(jìn)作用與GSPE濃度相關(guān)，2.5μg/ml時(shí)促進(jìn)作