葡萄籽原花青素對牙齦卟啉單胞菌LPS及BBF影響的實驗研究.pdf

1、背景和目的:
　　近年來，中醫(yī)在醫(yī)學領域發(fā)揮著越來越重要的作用。很多學者已發(fā)現(xiàn)中醫(yī)在治療口腔疾病方面的可行性。中草藥來源于天然植物，副作用小，不易使細菌產生耐藥性。葡萄籽原花青素(GSPE)是一種純天然的抗氧化劑，具有較強的抑菌作用。現(xiàn)研究表明牙齦卟啉單胞菌在牙髓、牙周疾病以及口臭的發(fā)生、發(fā)展中都發(fā)揮著重要作用。牙齦卟啉單胞菌是G-厭氧短桿菌，其分泌的內毒素(LPS)等毒力因子以及形成的生物膜(BBF)能夠逃避宿主的免疫防御系統(tǒng)，

2、破壞宿主牙周組織。目前GSPE對牙齦卟啉單胞菌抑制作用的研究鮮見報道。本實驗擬通過GSPE對牙齦卟啉單胞菌的內毒素及生物膜的影響作用研究，探索GSPE在治療口腔疾病方面的可行性，為研究開發(fā)預防牙周疾病以及口臭等方面的高效低毒的藥物及相關性食品奠定理論基礎。
　　材料和方法:
　　實驗一:GSPE對牙齦卟啉單胞菌的最低抑菌濃度
　　將牙齦卟啉單胞菌凍干菌在胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)內復蘇，增菌以及繼代培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)

3、好的菌株，用PBS緩沖液將菌液校正至0.5麥氏比濁標準的菌液備用。將GSPE用無菌去離子水配制原花青素溶液128mg/ml的原液，然后倍比稀釋配制不同濃度，取各濃度藥液1.50ml與50℃TSB瓊脂培養(yǎng)基13.50ml混勻，傾注平板使其終濃度為12.8mg/ml，6.4mg/ml，3.2mg/ml，1.6mg/ml，0.8mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml。分別取2ul菌液在不同濃度的平

4、板上點種。37℃厭氧培養(yǎng)48h。以肉眼所見平板上無細菌生長的最低濃度為GSPE的最低抑菌濃度。實驗重復三次
　　實驗二:采用鱟試驗測定GSPE對P.g產生LPS的影響
　　在無熱源管中，分別配制2mlGSPE溶液終濃度為0.8mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.025 mg/ml的TSB液體培養(yǎng)基，以及不含GSPE只有2mlTSB液體培養(yǎng)基的空白對照組，各組分別加入細菌混

5、懸液(1×106cfu/ml)0.1ml，37℃厭氧培養(yǎng)72h。分別吸取7組不同實驗樣品0.2ml加入鱟試劑中，振蕩后，置檢測儀上檢測。實驗重復三次。
　　實驗三:GSPE對牙齦卟啉單胞菌生物膜的影響
　　將配制好的菌液（1×106cfu/ml）分別加入96孔板中，每孔0.1ml。37℃恒溫厭氧培養(yǎng)5天后96孔板內壁附著生物膜。將96孔板中菌液傾出。96孔板分四組，1-3列為實驗組，自A-F行依次加入3.2mg/ml-0.1

6、 mg/ml梯度濃度的GSPE溶液。4-6為陽性對照組加入0.14％-0.0045％梯度濃度的次氯酸鈉，7-9為陰性對照組，10-12為背景對照組，只加藥液。培養(yǎng)24h后用PBS溶液輕柔清洗三次，結晶紫染色30分鐘后倒出清洗，脫氧膽酸鈉脫色30min后，置酶標儀測OD值。實驗重復六次。
　　結果:
　　1、肉眼可見，GSPE溶液濃度為0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.4mg/ml的TSB瓊脂培養(yǎng)基上

7、都長有少量細菌，而濃度為0.8mg/ml，1.6mg/ml，3.2mg/ml，6.4mg/ml，12.8mg/ml的TSB瓊脂培養(yǎng)基上均無細菌生長，故可認為0.8mg/mlGSPE溶液為最低抑菌濃度。
　　2、鱟實驗結果顯示，GSPE濃度為0.4mg/ml，0.2mg/ml，0.1 mg/ml，0.05mg/ml，0.025mg/ml時反應結果呈陽性，濃度為0.8mg/ml時反應結果呈陰性。統(tǒng)計結果顯示在0.05-0.4mg/ml

8、范圍內隨著GSPE濃度的升高，對LPS抑制作用增強。
　　3、經(jīng)過GSPE藥物及次氯酸鈉作用后的吸光值比沒有藥物作用的明顯減小，計算后的生物膜抑制率隨藥物濃度遞增而增加。與次氯酸鈉比較，GSPE對生物膜的清除作用不如次氯酸鈉好。
　　結論:
　　1.GSPE對牙齦卟啉單胞菌有顯著抑制作用，最低抑菌濃度為0.8mg/ml。
　　2、隨著GSPE濃度的升高，菌液中LPS含量越來越少，在0.05-0.4mg/ml濃度范