持續(xù)去甲腎上腺素輸注對早期膿毒癥大鼠的保護作用.pdf

1、目的：
　　膿毒癥(sepsis)是由感染引起的炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，其發(fā)病率和死亡率都很高。膿毒癥休克是膿毒癥患者的主要的并發(fā)癥之一，常導(dǎo)致多器官功能衰竭，甚至死亡。在膿毒癥休克中，兒茶酚胺類（腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺）藥物對于升高血壓和穩(wěn)定平均動脈壓和心輸出量有重要作用。2008年國際膿毒癥指南將去甲腎上腺素作為液體復(fù)蘇和多巴胺治療失敗

2、后的進一步治療措施。近年來研究發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素不僅可以用來升高平均動脈壓，也能降低炎癥因子和氧化應(yīng)激的水平、改善微循環(huán)和線粒體呼吸功能，但目前仍存在爭議。且隨著對膿毒癥認識的逐步加深，目前認為膿毒癥導(dǎo)致線粒體功能障礙的可能機制包括微循環(huán)障礙、炎癥因子的損傷作用、氧化應(yīng)激作用、一氧化氮過度表達和線粒體DNA損傷等。由此可見，去甲腎上腺素對危重病(尤其是膿毒癥)患者有一定的的保護和恢復(fù)作用。此外，肝臟是機體進行物質(zhì)和能量代謝的重要器官，并且

3、在膿毒癥早期極易受損。本動物實驗探討持續(xù)灌注低劑量去甲腎上腺素干預(yù)對早期膿毒癥大鼠血清炎癥因子、肝臟氧化應(yīng)激水平和線粒體呼吸功能的影響及其相關(guān)機制，并找出NE的適宜劑量，為臨床上減少膿毒癥嚴重并發(fā)癥的發(fā)生率和降低膿毒癥病死率提供新的方法和思路。
　　方法：
　　1.建立動物模型及分組
　　模型：膿毒癥模型采用腹腔注射10mg/kg脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立。分組：40只SD大鼠隨機分為5

4、組（各組大鼠在實驗前20-24h行右頸外靜脈置管術(shù)）：正常對照組（n=8）：腹腔注射生理鹽水10ml/kg（與實驗組LPS量一致），同時持續(xù)泵注生理鹽水1ml/h；
　　內(nèi)毒素組（n=8）：腹腔注射LPS10mg/kg，同時持續(xù)泵注生理鹽水1ml/h；去甲腎上腺素干預(yù)組（n=3*8，低劑量組、中劑量組和高劑量組各8只）：腹腔注射LPS10mg/kg，同時持續(xù)泵注去甲腎上腺素生理鹽水溶液1ml/h，去甲腎上腺用量分別為0.06、0.

5、3、0.6ug/kg/min。
　　2.檢測指標及方法
　　(1)大鼠一般情況：
　　觀察注射LPS前20min及注射后2h、6h、12h和24h的肛溫、心率和呼吸頻率。
　　(2)大鼠炎癥反應(yīng)指標：
　　運用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA法）檢測注射 LPS(或生理鹽水)后2h、6h的大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10的濃度。
　　(3)大鼠生化指標：
　　肝功能指標：運用全

6、自動生化分析儀檢測注射 LPS（或生理鹽水）后24h的大鼠血清ALT和AST水平。
　　(4)大鼠肝臟粒體損傷相關(guān)指標（注射LPS或生理鹽水后24h）：
　　①采用差速離心法提取大鼠肝臟線粒體，JC-1染料染色，流式細胞儀檢測肝臟線粒體腫脹程度和線粒體膜電位。
　　②運用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA法）檢測大鼠肝臟異檸檬酸脫氫酶活性和線粒體丙酮酸脫氫酶的相對活性。
　?、圻\用比色法檢測大鼠肝臟線粒體氧

7、化應(yīng)激相關(guān)指標（SOD、MDA、NO、iNOS）。
　　④電鏡觀察大鼠肝臟線粒體損傷狀況，按照Flameng分級方法對線粒體進行半定量評分。
　　3.統(tǒng)計方法
　　獲得的數(shù)據(jù) SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果用均值±標準差(±s)表示；多組間比較采用單因素方差分析，在多樣本均數(shù)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義時進行均數(shù)兩兩比較，方差齊性者采用LSD法分析組間差異，方差不齊者采用Games-Howell法分析組間差異；α值界定為

8、0.05。
　　結(jié)果：
　　1.動物一般情況：
　　內(nèi)毒素組和去甲腎上腺素干預(yù)組均出現(xiàn)膿毒癥相關(guān)癥狀體征。
　　2.大鼠炎癥反應(yīng)指標：
　?。?）各組大鼠血清TNF-α水平的比較
　　a、腹腔注射LPS（或生理鹽水）后2h血清TNF-α水平：與正常對照組相比，內(nèi)毒素組、干預(yù)組（低劑量和中劑量組）血清 TNF-α水平顯著升高(P=0.000、P=0.001、P=0.042)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（中劑

9、量和高劑量組）血清TNF-α水平顯著降低(P=0.037，P=0.039）；
　　b、腹腔注射LPS（或生理鹽水）后6h各組血清TNF-α水平均檢測不到。
　?。?）各組大鼠血清IL-1β水平的比較
　　a、腹腔注射LPS（或生理鹽水）后2h血清IL-1β水平：與正常對照組相比，內(nèi)毒素組、干預(yù)組（低劑量組）血清IL-1β水平顯著升高(P=0.07，P=0.04)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（中劑量組）血清IL-1β水平顯著

10、降低(P=0.02），
　　b、腹腔注射LPS（或生理鹽水）后6h血清IL-1β水平：與正常對照組相比，內(nèi)毒素組血清IL-1β水平顯著升高(P=0.033)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（中劑量組）血清IL-1β水平顯著降低(P=0.041）。
　?。?）各組大鼠血清IL-10水平的比較
　　a、腹腔注射LPS（或生理鹽水）后2h血清IL-10水平：與正常對照組相比，內(nèi)毒素組、干預(yù)組（低、中和高劑量組）血清IL-10水平均顯

11、著升高(P=0.001，P=0.000，P=0.000)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（中劑量組）血清IL-10水平顯著降低(P=0.032），
　　b、腹腔注射LPS（或生理鹽水）后6h血清IL-10水平：
　　與正常對照組相比內(nèi)毒素組、干預(yù)組（低、中和高劑量組）血清IL-10水平均顯著升高(P=0.001，P=0.000，P=0.000)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（中劑量組）血清IL-10水平顯著降低(P=0.048）。

12、　　3.大鼠生化指標：
　　腹腔注射LPS（或生理鹽水）后2h和6h的血清ALT、AST水平：與正常對照組相比，內(nèi)毒素組的血清ALT和AST均顯著升高(P=0.048，P=0.028)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組血清ALT和AST有下降趨勢，但均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.大鼠肝臟線粒體指標（注射LPS或生理鹽水后24h）
　?。?）各組大鼠肝臟線粒體腫脹程度和膜電位的比較
　　與正常對照組相比,內(nèi)毒素組和干預(yù)組（低劑量

13、組）肝臟線粒體膜電位顯著下降(P=0.013，P=0.008)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（高劑量組）肝臟線粒體膜電位顯著上升(P=0.03)。大鼠肝臟線粒體腫脹度無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　（2）各組大鼠肝臟丙酮酸脫氫酶（IDH）活性和肝臟線粒體異檸檬酸脫氫酶（IDH）活性水平的比較
　　與正常對照組相比,內(nèi)毒素組和干預(yù)組（低劑量組）肝臟線粒體PDH活性水平顯著下降(P=0.009，P=0.009)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（高劑量組）

14、肝臟線粒體PDH活性水平顯著上升(P=0.003)。
　　與正常對照組相比，內(nèi)毒素組肝臟線粒體IDH活性水平顯著下降(P=0.015)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（高劑量組）肝臟線粒體IDH活性水平與LPS組相比則顯著升高(P=0.027)。（3）各組大鼠肝臟線粒體SOD、MDA、NO、iNOS水平的比較
　　與正常組相比，各組大鼠肝臟線粒體iNOS、MDA和NO水平有升高的趨勢；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組有下降的趨勢，但均無統(tǒng)計學(xué)

15、差異。各組大鼠肝臟SOD水平無統(tǒng)計學(xué)差異。
　?。?）各組大鼠肝臟線粒體電鏡觀察及半定量分析
　　各組大鼠肝臟線粒體電鏡觀察改變不明顯，半定量分析無顯著差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.膿毒癥大鼠早期出現(xiàn)肝臟功能損傷、顯著的炎性損傷和線粒體功能受損，但線粒體形態(tài)損傷輕微。
　　2.持續(xù)輸注去甲腎上腺素對膿毒癥大鼠的有一定的保護和恢復(fù)作用，這與降低炎癥因子的水平及增強三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性和線粒體膜電