大鼠HDAC1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及其體外調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞心肌定向分化.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建及鑒定用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的HDAC1－RNAi慢病毒載體，評價RNAi慢病毒載體介導的對組蛋白去乙?；?（HDAC1）基因表達的抑制效果并檢測心肌早期發(fā)育相關(guān)結(jié)構(gòu)功能蛋白表達，初步探討乙?；揎椩诟杉毎鼗募蛹毎D(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，為基因聯(lián)合干細胞治療急性心肌梗死提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1．293T細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)，當細胞達80％融合時，用0.25％胰酶消化細胞，以1：4~1:2

2、0傳代擴增。
　　2．全骨髓貼壁法體外分離、培養(yǎng)、純化 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs），當細胞達80-90％融合時，用胰酶-EDTA(0.25％：0.05％)消化細胞進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行流式細胞儀細胞表面標記檢測鑒定。
　　3．根據(jù)HDAC1基因信息，設(shè)計4對小干擾序列及1對陰性對照(NC)序列，將靶向HDAC1的shRNA表達序列連接到慢病毒載體

3、pGCSIL-GFP中，獲得 pGCSIL-GFP-shHDAC1重組質(zhì)粒，測序鑒定正確后與慢病毒包裝質(zhì)粒pHelper1.0及pHelper2.0通過Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染至細胞293T，包裝產(chǎn)生病毒液，逐孔稀釋法測定病毒滴度。
　　4．包裝好的pGCSIL-GFP-NC Lentivirus以MOI0、1、10、100感染BMSCs，分別在感染后12h，24h，48h，72h后用.熒光顯微鏡觀察細胞熒光表達情

4、況，流式細胞術(shù)（488 nm波長）檢測感染效率，篩選出獲得最佳感染效率的MOI值及時間。
　　5．包裝好的5組病毒以最佳MOI值感染 BMSCs，48h后收集細胞，RT-QPCR檢測各組HDAC1 mRNA表達情況；Western Blot檢測各組 HDAC1表達情況，篩選出HDAC1基因沉默效率最佳的一組病毒。
　　6．篩選出的病毒以最佳MOI感染BMSCs，48h后觀測細胞形態(tài)；收集細胞，RT-QPCR分別檢測心肌發(fā)育相

5、關(guān)基因GATA-4、NKx2.5，心肌結(jié)構(gòu)相關(guān)基因肌鈣蛋白（CTnT）、肌球蛋白重鏈（MHC）及縫隙鏈接蛋白43（Connexin-43）mRNA的表達情況；
　　7．數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.293T細胞復(fù)蘇后，24h單層貼壁生長，細胞呈多邊形，形態(tài)均一；1：4~1:20傳代后生長狀態(tài)

6、良好，72h即可傳代或凍存。
　　2．原代及傳代的骨髓間充質(zhì)干細胞均呈成纖維細胞樣的長梭形，觀察形態(tài)較均一、飽滿，以1：2~1:4的分種率在72h小時內(nèi)可長滿，形態(tài)亦多呈長梭性，呈極性排列。第3代骨髓間充質(zhì)干細胞低表達造血標志CD34(0.64％)、CD45(0.35％)，強表達CD29(99.86％)，CD44(99.47％)，CD90（98.97％）等基質(zhì)細胞/間質(zhì)細胞表面標志。
　　3．核苷酸序列檢測結(jié)果表明，siRN

7、A表達模板成功構(gòu)建于pGCSIL-EGFP載體上，序列與目的序列相同。3質(zhì)粒包裝系統(tǒng)產(chǎn)生的病毒分別命名為LV-HDAC1-shRNA1、LV-HDAC1-shRNA2、LV-HDAC1-shRNA3、LV-HDAC1-shRNA4、LV-NC-shRNA；逐孔稀釋法測定病毒液的滴度分別為9×108TU/ml、8×108TU/ml、9×108TU/ml、9×108TU/ml、1.5×109TU/ml。
　　4．pGCSIL-GFP-

8、NC Lentivirus感染BMSCs12h后可觀測到EGFP表達，48h達到高峰，強綠色熒光可持續(xù)至72h后；MOI為1~10時，感染效率不足70%；MOI為100時，細胞生長狀態(tài)良好，與正常對照組細胞形態(tài)無明顯差異，感染效率達90%以上，流式細胞儀測得EGFP陽性標記率為93.65%。
　　5．HDAC1 mRNA在各組樣本均有表達，各干擾病毒感染組的表達量均顯著低于正常對照和陰性對照組，P值<0.05；正常對照組HDAC1

9、 mRNA的表達量分別為干擾組的32倍、11倍、13倍、96倍；各干擾組沉默效率達到90%以上。統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析表明，LV-HDAC-shRNA2和LV-HDAC1-shRNA3感染組間差異無顯著性；LV-HDAC1-shRNA1和LV-HDAC1-shRNA4感染組間差異無顯著性；Western blot結(jié)果分析與PCR結(jié)果吻合，各干擾組沉默效率達30%以上。即所構(gòu)建的4個針對HDAC1特異siRNA載體都對HDAC1的表達均有抑制作用，

10、其中，LV-HDAC1-shRNA1和LV-HDAC1-shRNA4相比于LV-HDAC-shRNA2和LV-HDAC1-shRNA3，對目的基因的抑制效果更為明顯。
　　6．篩選出的LV-HDAC1-shRNA4感染BMSCs，48h后細胞形態(tài)與正常對照組無明顯區(qū)別；RT-QPCR結(jié)果顯示干擾組干擾組心肌發(fā)育相關(guān)基因 GATA-4、NKx2.5，心肌結(jié)構(gòu)相關(guān)基因肌鈣蛋白（CTnT）、肌球蛋白重鏈（MHC）及縫隙鏈接蛋白43（Co

11、nnexin-43）的mRNA表達水平較正常組升高，P值<0.05。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了大鼠 HDAC1基因的siRNA慢病毒表達載體LV-HDAC1-shRNA，并通過慢病毒包裝體系獲得了較高滴度的病毒液。
　　2.慢病毒載體攜帶的外源基因能夠在受感染的骨髓間充質(zhì)干細胞中表達，且LV-HDAC1-shRNA在體外能特異且高效抑制BMSCs中HDAC1基因的mRNA和蛋白的表達水平；
　　3.通過RN