東北林蛙皮膚活性肽篩選組分抗腫瘤特性分析.pdf

1、目的：已有研究表明兩棲類皮膚活性肽具有廣譜抗病原微生物特性外，還有抗腫瘤活性，且對正常真核細(xì)胞幾乎無影響，因而從兩棲類皮膚活性肽中篩選具有抗腫瘤活性的多肽分子，使其成為抗腫瘤藥物候選分子的新來源具有重要的意義。
　　方法:以兩棲類代表物種東北林蛙（Rana dybowskii）為實驗對象，電刺激(5V，20Hz)蛙背部皮膚收集分泌物，優(yōu)化高效液相色譜(HPLC)純化條件，分離純化皮膚分泌物。篩選SAH水解酶活性抑制試驗陽性的純化肽

2、組分，MTT比色法檢測其篩選多肽對人前列腺癌細(xì)胞（PC-3）的存活率，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察初篩肽組分對Vero細(xì)胞、PC-3細(xì)胞鉀離子通道的影響。
　　結(jié)果:(1)優(yōu)化了東北林蛙皮膚活性肽HPLC最佳分離純化體系，即流動相為乙腈∶甲醇∶水-TFA(9∶1∶90)，流速為0.5ml/min，檢測波長為216nm和280nm，洗脫時間為30-40min。并從蛙皮膚分泌物中獲得14個肽組分dybowsMiiⅠ～ⅩⅣ。(2)SAH水解酶活

3、性抑制試驗顯示dybowskiiⅠ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅺ、ⅩⅣ對SAH水解酶均呈不同程度抑制。(3)MTT測定結(jié)果顯示dybowskiiⅠ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、ⅩⅣ隨濃度(0.015、0.03、0.06、0.12μ g/ml)遞增其PC-3細(xì)胞存活率均呈下降趨勢，尤以0.12μg/ml濃度dybowskiiⅥ最為顯著（降低至40.2％），而dybowskiiⅪ對PC-3細(xì)胞存活率幾乎無影響(91.5％)。倒置顯微鏡觀察PC-3細(xì)胞折光性增強、

4、細(xì)胞變圓、脫壁細(xì)胞增多。(4)全細(xì)胞膜片鉗顯示dybowskiiⅥ為0.12ug/ml時可抑制PC-3細(xì)胞延遲整流鉀離子通道，而對Vero細(xì)胞無影響。
　　結(jié)論:(1)建立了東北林蛙皮膚活性肽HPLC分離純化體系，即流動相為乙腈∶甲醇∶水-TFA(9∶1∶90)，流速為0.5ml/min，檢測波長216nm和280nm，洗脫時間30-40min。分離獲得14個皮膚活性肽組分dybowskiiⅠ～ⅩⅣ。(2)其中，dybowskii