外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和藥物代謝酶在二萜類化合物生物利用度屏障的作用及其機(jī)制.pdf

1、一.研究背景和目的
　　 藥物在體內(nèi)的吸收與代謝的處置過程中，存在著由外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和藥物代謝酶共同組成的生物利用度屏障。在生理上，這一生物防御屏障能夠阻礙外來物進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，從而避免機(jī)體受到外來物的侵?jǐn)_，但對(duì)于藥物而言，則嚴(yán)重影響其藥效與毒性。
　　 二萜類化合物中的毒效成分烏頭生物堿和活性成分穿心蓮內(nèi)酯在臨床上的使用越來越多。
　　 烏頭生物堿具有局麻、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、強(qiáng)心、抗炎、抗腫瘤等功效。然而由于其治療劑量和中

2、毒劑量非常接近，被中國(guó)以及其他一些國(guó)家藥典列為大毒藥，在臨床使用過程中，中毒事件頻頻發(fā)生。烏頭在使用前必須經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的煎煮，使毒性成分較大的烏頭堿(AC)、中烏頭堿(MA)、次烏頭堿（HA）大部分水解為毒性較小的苯甲酰烏頭原堿(BAC)、苯甲酰中烏頭原堿(BMA)、苯甲酰次烏頭原堿(BHA)、烏頭原堿(aconine)、中烏頭原堿(mesaconine)和次烏頭原堿。
　　 穿心蓮內(nèi)酯有降壓、抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗心肌缺

3、血及抗癌等作用。
　　 因此，本研究的目的是基于外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和藥物代謝酶研究烏頭生物堿和穿心蓮內(nèi)酯生物利用度屏障特征及分子機(jī)制，從而科學(xué)地認(rèn)知穿心蓮內(nèi)酯的有效性和烏頭生物堿的毒性與生物利用度屏障的關(guān)系，趨利避害，增加藥物的療效，減少藥物毒副反應(yīng)。
　　 二.方法
　　 采用大鼠藥代動(dòng)力學(xué)模型、Caco-2細(xì)胞模型、MDR1-MDCK（II）細(xì)胞模型，人肝微粒體和S9反應(yīng)體系，CYP酶單克隆抗體、人源化重組CYP酶

4、、大鼠在體腸灌流模型，高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，高分辨率質(zhì)譜，核磁分析技術(shù)。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)用mean±SD來表示。統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0。采用統(tǒng)計(jì)方法Students't-test或者One-wayANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 三.結(jié)果
　　 1.烏頭生物堿的藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　 大鼠灌胃給藥AC,MA和HA后，我們?cè)诖笫笱獫{里除了檢測(cè)到AC，MA和HA，還檢測(cè)到BAC，BMA，BHA，acon

5、ine和mesaconine。結(jié)果表明AC，MA和HA被水解代謝。AC，MA和HA的消除半衰期(T1/2β)分別是90.8±22.7min,155±66.4min,185±46.2min。BAC,BMA,BHA,aconine和mesaconine的T1/2β分別是526±324min，407±180min，552±142min，685±494min，399±151min。這些結(jié)果表明AC，MA和HA在體內(nèi)的消除比它們的代謝物BAC，B

6、MA，BHA，aconine和mesaconine要快很多，這預(yù)示著毒性越大的烏頭生物堿被機(jī)體消除的速率越快。
　　 2.AC,MA,HA,BAC,BMA,BHA,aconineandmesaconine在Caco-2和MDR1-MDCK(II)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)
　　 我們研究了烏頭類生物堿1μM在Caco-2細(xì)胞中從A(apical)到B(basolateral)方向和從B到A方向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。AC，MA和HA在Caco-2

7、細(xì)胞從A到B方向轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀滲透系數(shù)Papp值分別是(7.63±1.16×10-7)cm/s，(8.24±0.45×10-7)cm/s和(21.5±0.72×10-7)cm/s。而AC，MA和HA從B到A方向轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀滲透系數(shù)Papp值顯著性地高于(P＜0.05）它們從A到B方向的數(shù)值。AC，MA和HA的外排轉(zhuǎn)運(yùn)率Er值分別是34.6±4.2，29.7±2.1和15.6±2.1。BAC，BMA和BHA在Caco-2細(xì)胞從A到B方向轉(zhuǎn)運(yùn)的表

8、觀滲透系數(shù)Papp值分別是(5.02±1.28×10-7)cm/s，(5.84±2.37×10-7)cm/s和(9.17±1.49×10-7)cm/s。而BAC，BMA和BHA從B到A方向轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀滲透系數(shù)Papp值大約是它們從A到B方向的數(shù)值的4倍(P＜0.05）。它們的外排轉(zhuǎn)運(yùn)率Er值分別是5.2±1.4，4.5±2.4和4.4±0.9。Aconine和mesaconine在Caco-2細(xì)胞從A到B方向轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀滲透系數(shù)Papp值分

9、別是(12.1±3.01×10-7)cm/s和(10.4±2.27×10-7)cm/s。Aconine和mesaconine的外排轉(zhuǎn)運(yùn)率Er值分別是1.1±0.4和1.1±0.5。
　　 在cyclosporineA或者verapamil的作用下，AC，MA和HA的外排現(xiàn)象幾乎被完全抑制，外排轉(zhuǎn)運(yùn)率Er顯著的降低(P＜0.05），都降低到大約1.0。在這2個(gè)化學(xué)抑制劑的作用下，BAC，BMA和BHA的Er值都降低;aconine

10、和mesaconine的Er值沒有顯著性變化。與滲透性結(jié)果相一致，AC，MA和HA在細(xì)胞內(nèi)的含量，無論從A到B的方向轉(zhuǎn)運(yùn)還是從B到A的方向轉(zhuǎn)運(yùn)，都顯著地(P＜0.05）增加。在CyclosporineA或者verapamil單獨(dú)作用下，從A到B方向轉(zhuǎn)運(yùn)，AC在細(xì)胞內(nèi)的含量從2pmol增加到58pmol或者60pmol;MA在細(xì)胞內(nèi)的含量從1pmol增加到44pmol或者45pmol;而HA在細(xì)胞內(nèi)的含量3pmol增加到90pmol或者4

11、4pmol。BAC，BMA和BHA在細(xì)胞內(nèi)的含量，在化學(xué)抑制劑的作用下，也相應(yīng)地有所增加。然而，aconine和mesaconine在細(xì)胞內(nèi)的含量沒有顯著變化。
　　 1μMAC，MA和HA在MDR1-MDCK(II)細(xì)胞中從B到A方向的表觀滲透系數(shù)顯著地(P＜0.05）大于它們從A到B方向的滲透系數(shù)。AC，MA和HA在MDR1-MDCK(II)的外排轉(zhuǎn)運(yùn)率Er值顯著地(P＜0.05)大于它們?cè)贛DCK(II)細(xì)胞中的值，分別是

12、（22.2±2.6）比（1.8±0.5），（27.9±5.3）比（1.5±0.2），（10±1.3）比（1.4±0.3）。在MDR1-MDCK(II)細(xì)胞中，BAC，BMA，BHA，aconine和mesaconine的Er值與其在MDCK(II)細(xì)胞中的Er值沒有顯著性差異。從A到B方向轉(zhuǎn)運(yùn)或從B到A方向轉(zhuǎn)運(yùn)，AC，MA和HA在MDR1-MDCK(II)細(xì)胞的含量都顯著地小于它們?cè)贛DCK(II)細(xì)胞的含量（P＜0.05）;而BAC和

13、BHA從B到A方向轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，在這兩種細(xì)胞內(nèi)的含量有顯著性變化。從A到B方向轉(zhuǎn)運(yùn)或從B到A方向轉(zhuǎn)運(yùn)，mesaconine在MDR1-MDCK(II)細(xì)胞的含量都顯著地大于它們?cè)贛DCK(II)細(xì)胞的含量（P＜0.05）。綜合外排轉(zhuǎn)運(yùn)率和細(xì)胞內(nèi)含量的變化，我們推斷P-gp參與AC，MA和HA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 在Ko143的作用下，AC，MA，HA和BAC的Er值顯著地降低(P＜0.05）。在Ko143作用下，從A到B方向轉(zhuǎn)運(yùn)，AC在

14、細(xì)胞內(nèi)的含量從2pmol增加到71pmol;MA在細(xì)胞內(nèi)的含量從1pmol增加到47pmol;HA在細(xì)胞內(nèi)的含量從3pmol增加到112pmol;BHA在細(xì)胞內(nèi)的含量也顯著增加;而BAC，BMA，aconine和mesaconine在細(xì)胞內(nèi)的含量沒有顯著變化。綜合外排轉(zhuǎn)運(yùn)率和細(xì)胞內(nèi)含量的變化，我們推斷Bcrp可能參與AC，MA和HA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 在MK571的作用下，AC，MA和HA的Er值顯著的降低(P＜0.05）。BA

15、C，BMA和BHA的Er值也顯著地降低(P＜0.05）。在MK571作用下，從A到B方向轉(zhuǎn)運(yùn)，AC在細(xì)胞內(nèi)的含量從2pmol增加到81pmol;MA在細(xì)胞內(nèi)的含量從1pmol增加到48pmol;HA在細(xì)胞內(nèi)的含量從3pmol增加到101pmol。BAC，BMA和BHA在細(xì)胞內(nèi)的含量也顯著增加;而aconine和mesaconine在細(xì)胞內(nèi)的含量沒有顯著變化。綜合外排轉(zhuǎn)運(yùn)率和細(xì)胞內(nèi)含量的變化，我們推斷Mrp2可能參與AC、MA、HA、BA

16、C、BMA和BHA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 3.烏頭生物堿體外CYP酶代謝研究
　　 中烏頭堿在人的肝微粒體中至少生成9個(gè)代謝產(chǎn)物(M1～M9)，主要的代謝途徑包括去甲基，脫氫，羥基化，脫氫-去甲基。我們選用了一系列CYP酶亞型的化學(xué)抑制劑去確認(rèn)參與MA代謝的CYP酶亞型。由結(jié)果推斷MA的代謝主要是由CYP3A介導(dǎo)，CYP2C8，2C9，2C19和2D6也有一定的作用，CYP1A2和2E1幾乎沒有參與其代謝。接著，我們選用了一

17、系列的人源化重組CYP酶驗(yàn)證參與MA代謝的CYP酶亞型。在MA的代謝中，CYP3A發(fā)揮著最重要的作用;CYP2C8，2C9，2C19和2D6發(fā)揮部分作用，CYP1A2和2E1的作用很小。
　　 次烏頭堿在人的肝微粒體中至少生成11個(gè)代謝產(chǎn)物(M1～M11)，主要的代謝途徑包括去甲基，脫氫，羥基化，脫氫-去甲基，脫二甲基。我們鑒定了代謝產(chǎn)物M8為中烏頭堿?；瘜W(xué)抑制劑、單克隆抗體和人源化重組CYP酶實(shí)驗(yàn)表明HA的代謝主要由CYP3A

18、介導(dǎo)。CYP2C19、2D6和2E1在其代謝中也發(fā)揮部分的作用;而CYP1A2和2C8幾乎不參與其代謝。
　　 4.穿心蓮內(nèi)酯的生物利用度屏障特征
　　 大鼠灌胃給藥穿心蓮內(nèi)酯120mg/kg，血藥峰濃度Cmax是0.23±0.05μg/mL，達(dá)峰的時(shí)間是29.75±0.5min;其后，它的消除半衰期時(shí)間T1/2β是142.30±34.48min，它的血藥濃度時(shí)間曲線下面積AUCo-∞是29.45±3.73μg·min/

19、mL。而大鼠靜脈尾靜脈注射穿心蓮內(nèi)酯24mg/kg后，它的消除半衰期、清除率，血藥濃度時(shí)間曲線下面積分別是157.60±74.09min，109.24±8.99ml/min/kg和220.83±18.26μg·min/mL。因此根據(jù)口服生物利用度計(jì)算公式，得到穿心蓮內(nèi)酯的口服生物利用度是2.67％。
　　 為了探索穿心蓮內(nèi)酯生物利用度低的原因，我們研究了穿心蓮內(nèi)酯在Caco-2細(xì)胞上的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯從B側(cè)到A側(cè)

20、轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀滲透系數(shù)Papp值(4.94×10-5cm/s)顯著地(P＜0.05)高于其從A側(cè)到B側(cè)的數(shù)值(1.14×10-5cm/s)。穿心蓮內(nèi)酯的吸收滲透系數(shù)Papp值為(1.14×10-5cm/s)，這表明穿心蓮內(nèi)酯滲透性較高，跨膜容易，吸收差不是造成穿心蓮內(nèi)酯生物利用度差的原因。
　　 為了進(jìn)一步研究清楚參與穿心蓮內(nèi)酯跨膜的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，我們選用了MDR1-MDCK(II)細(xì)胞研究穿心蓮內(nèi)酯的跨膜情況。MDR1-MDCK(

21、II)細(xì)胞過表達(dá)人的mdr-1基因，也就是P-gp。我們同時(shí)選用了P-gp表達(dá)水平較低的MDCK(II)細(xì)胞作為陰性對(duì)照。通過比較穿心蓮內(nèi)酯在這兩種細(xì)胞的外排轉(zhuǎn)運(yùn)率，確認(rèn)P-gp對(duì)穿心蓮內(nèi)酯跨膜的作用。穿心蓮內(nèi)酯在MDR1-MDCK(II)的外排轉(zhuǎn)運(yùn)率是其在MDCK(II)細(xì)胞的4倍，這表明P-gp介導(dǎo)著穿心蓮內(nèi)酯的跨膜，能夠把穿心蓮內(nèi)酯從血漿中外排至腸腔，造成穿心蓮內(nèi)酯生物利用度低。
　　 腸道酶對(duì)穿心蓮內(nèi)酯有水解作用，其中十

22、二指腸和空腸酶的水解作用較強(qiáng)。特別是在十二指腸中，1h內(nèi)穿心蓮內(nèi)脂被水解了約70％，8h內(nèi)幾乎完全被水解;空腸中，1h內(nèi)被水解了約50％。而在回腸和結(jié)腸中，腸道酶對(duì)穿心蓮內(nèi)酯的水解作用較弱，1h內(nèi)約10％。
　　 在灌流過程中，穿心蓮內(nèi)酯在各腸段被吸收的量存在顯著性差異（P＜0.05）。穿心蓮內(nèi)酯的表觀滲透系數(shù)（P*eff是十二指腸＞空腸＞回腸、結(jié)腸。由于穿心蓮內(nèi)酯存在代謝，扣除代謝的部分，其滲透系數(shù)有所降低，但其在腸段吸收的趨

23、勢(shì)沒有改變，仍然是十二指腸＞空腸＞回腸、結(jié)腸。在灌流過程中，穿心蓮內(nèi)酯經(jīng)膽汁排泄的總量是39.4nmol，約等于吸收總量的1％。
　　 為了研究清楚穿心蓮內(nèi)酯在各腸段吸收的差異性，我們?cè)诖笫笤隗w灌流模型中進(jìn)一步研究了穿心蓮內(nèi)酯在外排蛋白P-gp的抑制劑維拉帕米和外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Bcrp的抑制劑雙嘧達(dá)莫的作用下的各腸段的吸收。根據(jù)參考文獻(xiàn)和抑制劑的半數(shù)有效抑制有效濃度，我們選定維拉帕米的灌流濃度為100μM，雙嘧達(dá)莫的濃度為50μM，

24、這兩個(gè)濃度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于它們各自的半數(shù)有效抑制濃度。我們采用上述的灌流方法，設(shè)定了三組實(shí)驗(yàn)，每組4只大鼠:灌流液分別是穿心蓮內(nèi)酯(40μM)和維拉帕米(100μM)的混合溶液;穿心蓮內(nèi)酯(40μM)和雙嘧達(dá)莫(50μM)的混合溶液;穿心蓮內(nèi)酯(40μM)、維拉帕米(100μM)和雙嘧達(dá)莫(50μM)的混合溶液。所得的樣品根據(jù)上述方法進(jìn)行分析，結(jié)果采用One-wayANOVA的分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　 結(jié)果顯示在維拉帕米的作用下，穿心

25、蓮內(nèi)酯在回腸和結(jié)腸中的表觀滲透系數(shù)顯著性（P＜0.05）地增加了，但其在十二指腸和空腸中沒有顯著性變化。在雙嘧達(dá)莫的作用下，穿心蓮內(nèi)酯在各腸段的表觀滲透系數(shù)沒有顯著性(P＜0.05）變化。然而，在維拉帕米和雙嘧達(dá)莫的作用下，穿心蓮內(nèi)酯在回腸和結(jié)腸的表觀滲透系數(shù)顯著性(P＜0.01)地增大，但仍然沒有改變其在十二指腸和空腸中的表觀滲透系數(shù)，穿心蓮內(nèi)酯呈腸段吸收依賴性的現(xiàn)象消失了。
　　 在抑制劑的作用下，在灌流60min后，穿心蓮

26、內(nèi)酯經(jīng)膽汁排泄的量也大大地(P＜0.05）增加。
　　 在穿心蓮內(nèi)酯灌流樣品分析中，通過對(duì)比空白樣品和含藥灌流樣品，我們?cè)谄涫改c和空腸灌流液中的色譜圖中，發(fā)現(xiàn)了穿心蓮內(nèi)酯的一個(gè)代謝產(chǎn)物，其保留時(shí)間是1.91min，通過高分辨質(zhì)譜(Bruker，USA)測(cè)得它的精確分子量是413.1657，根據(jù)精確分子量推測(cè)得到的分子式是C20H29O7S。我們把十二指腸和空腸的灌流液冷凍干燥濃縮后，加入100％甲醇溶解，13000rpm離心

27、30min，取出上清液。再用少量的H2O/MeOH(9:1)溶液溶解，加載到自己填充好的ODS柱子(2×10cm，10μm)，再用H2O/MeOH(9:1)溶液洗脫，收集洗脫液，UPLC-MS/MS測(cè)定每一份洗脫液，合并含有代謝物組分的洗脫液，濃縮后，進(jìn)行核磁分析(BRUKER300，inCD3OD，75MHzfor13C)。在核磁分析中，它的碳信號(hào)跟先前的文獻(xiàn)報(bào)道的物質(zhì)14-脫氧-12-磺酸化-穿心蓮內(nèi)酯非常相似。在灌流實(shí)驗(yàn)中，統(tǒng)計(jì)分