茯苓類藥材中茯苓三萜類化合物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、茯苓類藥材來源于多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos(Schw.) Wolf）的干燥菌核。根據(jù)入藥部位和功效不同，常分為茯苓皮、赤茯苓、茯苓、茯神四種。茯苓皮是茯苓菌核的外皮部分，有利水消腫之功效；赤茯苓為茯苓菌核近外表皮部淡紅色部分，有行水利濕熱、益心潤肺之功效；茯苓為菌核中間白色部分，有利水滲濕、益脾和胃之功效；茯神為菌核中心抱有松根部分，有寧心、安神、利水之功效。隨著茯苓皮、赤茯苓、茯苓、茯神入藥部位由表及里，其行水利尿作用逐

2、漸減弱而寧心安神作用增強(qiáng)。化學(xué)成分研究表明茯苓三萜類化合物是茯苓類藥材的主要活性物質(zhì)，種類多樣。
　　目前為止，茯苓不同藥用部位的茯苓三萜類化合物在體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)差異尚無系統(tǒng)研究，因此尚不明確造成茯苓類藥材功效之間差異的具體化學(xué)成分和作用機(jī)制。本研究利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，建立一個(gè)可同時(shí)定量分析大鼠血漿中多種茯苓三萜類化合物的方法，應(yīng)用于比較茯苓類藥材在大鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)方面的差異，并發(fā)現(xiàn)和鑒定茯苓皮提取

3、液在大鼠體內(nèi)的代謝物，推測(cè)可能的代謝途徑。
　　第一部分：茯苓類藥材中茯苓三萜類化合物的藥物動(dòng)力學(xué)比較
　　目的：建立生物樣品中茯苓類藥材8種茯苓三萜類化合物的UHPLC-Q-TOF-MS/MS定量測(cè)定方法，研究茯苓類藥材在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)特征，初步探討其藥物動(dòng)力學(xué)的差異。
　　方法：
　　1.茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮灌胃液的制備：將茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮用90％乙醇加熱回流提取，提取液過濾，減壓除醇，

4、加適量水溶解，分別制備成茯神灌胃液（相當(dāng)于2.5 g/mL原藥材）、茯苓灌胃液（相當(dāng)于2.5 g/mL原藥材）、赤茯苓灌胃液（相當(dāng)于2.0 g/mL原藥材）、茯苓皮灌胃液（相當(dāng)于2.0 g/mL原藥材）。
　　2.生物樣品的采集和預(yù)處理：取24只250±30 g的雄性Sprague-Dawley大鼠，隨機(jī)分為4組，按體重以生藥材25 g/kg的給藥量，分別灌胃給予上述4種溶液。茯神、茯苓、茯苓皮分別于給藥后5 min，10 min

5、，30 min，1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，36 h，48 h；赤茯苓于給藥后10 min，30 min，1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，36 h，48 h，72 h眼內(nèi)眥靜脈叢取血，采用乙腈沉蛋白的方法處理血漿樣品。
　　3.樣品分析條件：采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)。ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm，5μm）色譜柱。流動(dòng)相為0.5‰甲酸-

6、0.5 mM乙酸銨水溶液和乙腈。ESI電離，子離子掃描模式，在負(fù)離子模式下檢測(cè)茯苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、豬苓酸C、茯苓新酸AM、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸、常春藤皂苷元。采用高分辨的單個(gè)子離子計(jì)算峰面積，并采用內(nèi)標(biāo)法加權(quán)（1/x2）一元線性回歸定量。
　　4.藥物動(dòng)力學(xué)研究與分析：根據(jù)測(cè)定結(jié)果，繪制藥時(shí)曲線，采用DAS3.0非房室模型計(jì)算藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并比較4種藥材給藥的藥物動(dòng)力學(xué)差異。
　　結(jié)果：大鼠血漿中茯

7、苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、豬苓酸C、茯苓新酸AM、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸在測(cè)定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.9930）。批內(nèi)、批間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10.3%，相對(duì)誤差（RE）為-6.1%~7.7%。基質(zhì)效應(yīng)于91.4%~112.3%范圍內(nèi)，平均提取回收率為72.6%~102.6%。茯苓新酸AM在各組中均無吸收，茯苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、豬苓酸C、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸在茯苓皮組中吸收量

8、最大。
　　結(jié)論：本方法快速、靈敏、專屬、穩(wěn)定，可以用于茯苓類藥材在體內(nèi)成分的測(cè)定，為研究茯苓類藥材藥理作用機(jī)制提供了依據(jù)。
　　第二部分：茯苓皮在大鼠體內(nèi)吸收組分和代謝物的鑒定
　　目的：采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，結(jié)合 Peakview和MetabolitePilot數(shù)據(jù)分析軟件，分析鑒定茯苓皮在大鼠血漿、膽汁和尿液中的吸收組分和代謝物，探索其活性成分在體內(nèi)的代謝途徑。
　　方法：
　

9、　1.茯苓皮灌胃液的制備：將茯苓皮用90%乙醇加熱回流提取，提取液過濾，減壓除醇，用水稀釋至相當(dāng)于2.0 g/mL的原藥材。
　　2.生物樣品的采集和預(yù)處理：取12只雄性Sprague-Dawley大鼠，體重250±30 g，隨機(jī)分為4組，每組3只，按體重以25 g/kg的給藥量灌胃給予大鼠，分別采集給藥后1、2、4、8、12、24和36 h時(shí)的血漿樣品，24 h的膽汁樣品和72 h的尿液，分別合并所有的血漿、膽汁樣品和尿樣。將合

10、并的生物樣品分別用3倍量的乙酸乙酯萃取，萃取3次，每次15 min。合并乙酸乙酯層，減壓干燥，殘?jiān)眉状既芙狻?br>　　3.樣品分析條件：采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析樣品。色譜柱為Phenomenex Luna3μ C18（2）100A（150×2.0 mm），流動(dòng)相為2 mmol/L的乙酸銨-0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫；高分辨質(zhì)譜采用ESI源，負(fù)離子模式，全掃描采集，采用動(dòng)態(tài)背景扣除和信息依賴采集觸發(fā)二級(jí)

11、碎片的采集，每一循環(huán)采集8個(gè)最強(qiáng)峰的二級(jí)質(zhì)譜圖。
　　4.代謝物發(fā)現(xiàn)和鑒定的步驟：首先結(jié)合文獻(xiàn)，建立茯苓皮中茯苓三萜類已知化合物的信息庫。然后用 Peakview2.0軟件尋找血漿中的吸收組分、膽汁和尿樣中的原型藥物。再將這些吸收組分按照結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分類，選擇有對(duì)照品且吸收量較大的化合物作為母藥，用MetabolitePilot1.5軟件以母藥為模板進(jìn)行分析，尋找生物樣品中主要代謝物。最后根據(jù)茯苓三萜類的裂解規(guī)律和化合物的極性，解

12、析代謝物的結(jié)構(gòu)，及其可能的代謝轉(zhuǎn)化途徑。
　　結(jié)果：通過Peakview2.0，在血漿中尋找到15種主要的吸收組分；按結(jié)構(gòu)將其分為4類，其中3類分別以茯苓酸、茯苓新酸A和去氫土莫酸為母藥；利用MetabolitePilot1.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，尋找并初步鑒定其代謝物，共鑒定出102種成分，主要的代謝類型為甲基化、氧化、水解、氫化和葡萄糖醛酸結(jié)合等。
　　結(jié)論：本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)，成功發(fā)現(xiàn)和鑒定