雷帕霉素對(duì)顳葉癲癇齒狀回頭奮性環(huán)路的影響.pdf

1、第一部分:雷帕霉素抑制mTOR信號(hào)通路在匹羅卡品誘發(fā)顳葉癲癇小鼠海馬組織中的激活
　　 目的:觀察mTOR（mammalian target of rapamycin）信號(hào)通路在匹羅卡品誘發(fā)顳葉癲癇小鼠海馬組織中的激活及雷帕霉素對(duì)mTOR信號(hào)通路的抑制作用。
　　 方法:6-8周成年健康雄性C57BL/6小鼠(體重20-25g)，隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(n=20，注射生理鹽水)，陽(yáng)性對(duì)照組(n=20，注射匹羅卡品)，空載體組

2、（n=20，注射匹羅卡品+載體），雷帕霉素干預(yù)組(n=20，注射匹羅卡品+雷帕霉素)。陽(yáng)性對(duì)照組，空載體組及雷帕霉素干預(yù)組均采用東莨菪堿-匹羅卡品腹腔注射建立顳葉癲癇模型;陰性對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水。雷帕霉素干預(yù)組小鼠在東莨菪堿-匹羅卡品誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)后24h開(kāi)始腹腔注射雷帕霉素(6 mg/kg)，第1周每天一次，之后隔天注射一次;空載體組按同樣方法注射等劑量載體介質(zhì)。各組在癲癇持續(xù)狀態(tài)后或生理鹽水注射后3d，5d，1w，2w，8

3、w，用Western blot方法檢測(cè)mTOR信號(hào)通路下游因子核糖體蛋白S6的表達(dá)(S6)及磷酸化(p-S6)。
　　 結(jié)果:1.mTOR信號(hào)通路在匹羅卡品誘發(fā)顳葉癲癇小鼠海馬組織中的激活:陽(yáng)性對(duì)照組小鼠海馬組織p-S6/S6在癲癇持續(xù)狀態(tài)后3d到5d較陰性對(duì)照組顯著升高(one way ANOVO，P＜0.001)，并在2周內(nèi)維持在較高水平(one way ANOVO，P＜0.01)，后逐漸下降，直到8周p-S6/S6仍明顯高

4、于陰性對(duì)照組(one way ANOVO，P＜0.01)，提示mTOR信號(hào)通路在匹羅卡品誘發(fā)顳葉癲癇小鼠海馬組織中持續(xù)慢性激活。
　　 2.雷帕霉素對(duì)mTOR信號(hào)通路的抑制作用:空載體組mTOR信號(hào)通路在癲癇持續(xù)狀態(tài)后各時(shí)間點(diǎn)均顯著激活;而雷帕霉素干預(yù)組小鼠海馬組織p-S6/S6在各時(shí)間點(diǎn)均較空載體組明顯下降(one wayANOVO，P＜0.01)，提示雷帕霉素抑制匹羅卡品誘發(fā)顳葉癲癇海馬組織中mTOR信號(hào)通路的激活。

5、　　 結(jié)論:mTOR信號(hào)通路在匹羅卡品誘發(fā)顳葉癲癇小鼠海馬組織中持續(xù)慢性激活，雷帕霉素可抑制mTOR信號(hào)通路的激活。
　　 第二部分:雷帕霉素對(duì)顳葉癲癇小鼠齒狀回興奮性環(huán)路的影響
　　 目的:觀察雷帕霉素抑制mTOR信號(hào)通路后對(duì)顳葉癲癇小鼠齒狀回興奮性環(huán)路主要特征的影響，包括顆粒細(xì)胞自發(fā)興奮性突觸后電流及逆向刺激苔蘚纖維誘發(fā)的興奮性突觸后電流，及癲癇樣發(fā)放的影響。
　　 方法:6-8周成年健康雄性C57BL/6

6、小鼠(體重20-25g)，隨機(jī)分為陰性對(duì)照組（n=8，注射生理鹽水），陽(yáng)性對(duì)照組（n=8，注射匹羅卡品），空載體組（n=8，注射匹羅卡品+載體），雷帕霉素干預(yù)組（n=8，注射匹羅卡品+雷帕霉素）。各組建模同第一部分。在癲癇持續(xù)狀態(tài)后或生理鹽水注射后8周，取小鼠海馬組織切片（300μm），用全細(xì)胞膜片鉗記錄齒狀回顆粒細(xì)胞自發(fā)興奮性突觸后電流及逆向刺激苔蘚纖維誘發(fā)的興奮性突觸后電流，用細(xì)胞外記錄觀察癲癇樣發(fā)放。
　　 結(jié)果:1.雷帕

7、霉素抑制顳葉癲癇齒狀回顆粒細(xì)胞自發(fā)興奮性突觸后電流的幅度及頻率:將齒狀回顆粒細(xì)胞自發(fā)興奮性突觸后電流的幅度及頻率進(jìn)行累積頻率分布統(tǒng)計(jì)后，結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照組齒狀回顆粒細(xì)胞自發(fā)興奮性突觸后電流的幅度較陰性對(duì)照組升高（Kolmogorov-Smirnov two-sample test，P＜0.01），頻率顯著升高（Kolmogorov-Smirnov two-sample test，P＜0.001）;雷帕霉素干預(yù)組齒狀回顆粒細(xì)胞自發(fā)興奮性突

8、觸后電流幅度較空載體組下降（Kolmogorov-Smirnov two-sample test，P＜0.05），頻率顯著下降(Kolmogorov-Smirnov two-sample test, P＜0.001)。
　　 2.雷帕霉素抑制顳葉癲癇逆向刺激苔蘚纖維誘發(fā)齒狀回顆粒細(xì)胞的興奮性突觸后電流:陽(yáng)性對(duì)照組逆向刺激苔蘚纖維誘發(fā)的齒狀回顆粒細(xì)胞興奮性突觸后電流的幅度為141.7±17.9pA，而陰性對(duì)照組僅為38.9±3.9

9、pA，陽(yáng)性對(duì)照組較陰性對(duì)照組顯著升高(one way ANOVO，P＜0.001);雷帕霉素干預(yù)組逆向刺激苔蘚纖維誘發(fā)齒狀回顆粒細(xì)胞的興奮性突觸后電流的幅度為55.4±5.2pA，而空載體組為164.1±16.1pA，雷帕霉素干預(yù)組較空載體組顯著降低(one wayANOVO，P＜0.001)。
　　 3.雷帕霉素抑制顳葉癲癇齒狀回顆粒細(xì)胞癲癇樣發(fā)放:細(xì)胞外記錄觀察齒狀回顆粒細(xì)胞癲癇樣發(fā)放。在正常的人工腦脊液中，所有組腦片均未表

10、現(xiàn)出癲癇樣發(fā)放;而在高鉀及抑制GABAa通道的情況下，8只陰性對(duì)照組無(wú)癲癇樣發(fā)放，8只陽(yáng)性對(duì)照組中有3只小鼠表現(xiàn)出癲癇樣發(fā)放(統(tǒng)計(jì)突觸后場(chǎng)電位的個(gè)數(shù)顯示兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，one way ANOVO，P＜0.01);8只空載體組中有2只小鼠表現(xiàn)出癲癇樣發(fā)放，8只雷帕霉素干預(yù)組小鼠無(wú)癲癇樣發(fā)放(統(tǒng)計(jì)突觸后場(chǎng)電位的個(gè)數(shù)顯示兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，one way ANOVO，P＜0.05)。
　　 結(jié)論:雷帕霉素抑制顳葉癲癇小鼠齒狀回

11、顆粒細(xì)胞自發(fā)興奮性突觸后電流的活性，逆向刺激苔蘚纖維誘發(fā)的興奮性突觸后電流幅度及癲癇樣發(fā)放，從而對(duì)齒狀回興奮性環(huán)路產(chǎn)生抑制作用。
　　 第三部分:雷帕霉素對(duì)顳葉癲癇小鼠齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維出芽的影響
　　 目的:觀察雷帕霉素抑制mTOR通路激活后對(duì)齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維出芽的影響。
　　 方法:用于電生理記錄的腦片經(jīng)0.4％ Na2S溶液浸泡15分鐘，在4％多聚甲醛溶液中浸泡過(guò)夜，再用冰凍切片機(jī)切成30μm厚切

12、片，行Timm染色，觀察各組齒狀回內(nèi)分子層苔蘚纖維出芽的情況。
　　 結(jié)果:雷帕霉素抑制顳葉癲癇齒狀回內(nèi)分子苔蘚纖維出芽:陽(yáng)性對(duì)照組在癲癇持續(xù)狀態(tài)8周后，齒狀回內(nèi)分子層可見(jiàn)明顯苔蘚纖維出芽，尤其是表現(xiàn)出癲癇樣發(fā)放的腦片苔蘚纖維出芽更明顯，陰性對(duì)照組在生理鹽水注射8周后，齒狀回內(nèi)分子層未見(jiàn)苔蘚纖維出芽(Timm評(píng)分，one way ANOVO，P＜0.01);雷帕霉素干預(yù)組在癲癇持續(xù)狀態(tài)8周后，齒狀回內(nèi)分子層僅可見(jiàn)少量苔蘚纖維出芽