胎肝干細(xì)胞治療不同類型F344大鼠急性肝衰竭的實驗研究及大鼠門靜脈分支殘端置管模型構(gòu)建.pdf

1、急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是各種肝臟疾病主要的致死原因之一,以進(jìn)展迅速的肝性腦病以及嚴(yán)重的肝功能損害為特點。肝臟移植被認(rèn)為是對急性肝衰竭最佳最有效的治療方法,然而供肝的缺乏是嚴(yán)重阻礙著肝移植的廣泛開展和應(yīng)用的瓶頸。細(xì)胞移植因其優(yōu)點也成為替代肝移植手術(shù)治療急、慢性終末期肝病最有前景的方法[1,2]。胎肝干/祖細(xì)胞(FLSPCs)為干細(xì)胞治療各種肝病的最理想細(xì)胞之一。本實驗利用課題組之前報道的三部分離法在F

2、344胎鼠中有效富集、純化、體外擴(kuò)增胎肝干細(xì)胞,并用pAcGFP1-N1轉(zhuǎn)染干細(xì)胞,使其能表達(dá)GFP(green fluorescence protein,GFP)作為示蹤。以同種F344大鼠作為實驗對象,利用四氯化碳腹腔注射制造急性藥物性肝衰竭大鼠模型、外科手術(shù)方法切除85％大鼠肝臟,制作急性肝損傷肝衰竭大鼠模型。12小時后將轉(zhuǎn)染后的胎肝干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈途徑分別注射入上述模型體內(nèi),分選不同時間段觀察肝臟修復(fù)情況。于干細(xì)胞移植后12小時后

3、,治療組與對照組肝功能即出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義,72小時凝血檢查、病死率及肝臟病理切片檢查均顯示治療組優(yōu)于對照組。在驗證胎肝干細(xì)胞治療急性肝衰竭的可能性和有效性的基礎(chǔ)上,構(gòu)建大鼠肝臟斷面門靜脈分支的殘端靜脈置管模型,利用胎肝干細(xì)胞經(jīng)過不同的移植途徑驗證新模型的優(yōu)劣。肝功檢查結(jié)果表明經(jīng)新模型置管途徑移植細(xì)胞治療效果等同于經(jīng)門靜脈穿刺移植治療效果。以此得出結(jié)論:1.三步分離法提取的胎肝干細(xì)胞具有一定改善急性肝衰竭大鼠的肝功能、凝血及肝臟病理指標(biāo)的作

4、用。2.經(jīng)門靜脈分支殘端置管途徑移植FLSPCs效果等同于經(jīng)門靜脈穿刺途徑。
　　目的:
　　1.研究移植胎肝臟原始/干細(xì)胞對治療藥物性急性肝功能衰竭及急性損傷性肝衰竭大鼠的可能性與有效性。
　　2.構(gòu)建大鼠肝臟斷面門靜脈分支的殘端靜脈置管模型,并在實驗一的基礎(chǔ)上進(jìn)行不同途徑的胎肝干細(xì)胞細(xì)胞移植實驗,以此來對比分析新模型的優(yōu)劣。
　　方法:
　　1.胎肝干細(xì)胞的富集、純化和轉(zhuǎn)染示蹤
　　于胎齡14d的

5、F344孕鼠中提取胎肝,經(jīng)酶消化后,利用三步分離法進(jìn)行FLSPCs的提取、純化、體外擴(kuò)增。并用pAcGFP1-N1轉(zhuǎn)染干細(xì)胞,使其能表達(dá)GFP作為示蹤。
　　2.急性肝衰竭動物模型的構(gòu)建、干細(xì)胞的植入以及測定移植修復(fù)的指標(biāo)
　　將80只F344大鼠分為四組。A、B組按3ml/kg予腹腔一次性注射四氯化碳(CCl4)溶液,C、D兩組行肝臟85%切除,12小時后予以B、D兩治療組尾靜脈注射1×106個胎肝干細(xì)胞,A、C兩對照組注

6、射等劑量培養(yǎng)液,在不同時間段提取四組大鼠血清,測定肝功能ALT、AST、TBIL、ALB,及凝血指標(biāo)PT,統(tǒng)計死亡率、腹水生成量;取肝臟組織切片觀察其修復(fù)情況。
　　3.構(gòu)建大鼠肝斷面門靜脈分支殘端的靜脈置管模型,并進(jìn)行胎肝干細(xì)胞的細(xì)胞移植實驗,進(jìn)行肝臟修復(fù)指標(biāo)測試以對比分析新模型的優(yōu)劣。
　　60只F344大鼠分為三組。E、F組行行85%肝切除術(shù);G組行85%肝切除術(shù)+肝斷面門靜脈分支殘端置管術(shù)。術(shù)中F組經(jīng)門靜脈注入4×1

7、05個表達(dá)GFP(green fluorescence protein,GFP)的胎肝干細(xì)胞(fetal liver stem/progenitor cells,FLSPCs)。G組經(jīng)留置導(dǎo)管注射入同等量的FLSPCs,E組注射同等劑量的培養(yǎng)液。72小時取血清,測定肝功能ALT、AST,統(tǒng)計死亡率;取肝臟組織切片觀察其修復(fù)情況。統(tǒng)計學(xué)采用方差分析和LSD-t檢驗。
　　結(jié)果:
　　1.三步分離法能有效從14d胎齡的F344孕

8、鼠胚胎肝臟中富集FLSCs。細(xì)胞增殖速度快、貼壁快,細(xì)胞長滿后呈鋪路石樣外觀。細(xì)胞體積小、大小、形態(tài)均勻一致,多呈三角形或多角形,核漿比例較大。
　　2.在移植胎肝干細(xì)胞后12小時后,兩模型組內(nèi)的肝功能指標(biāo)檢測(ALT、AST、TBIL、ALB)即開始出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。A組ALT、AST、TBIL、ALB均值分別為(5404.17±376.94)U/L、(6823±348.99)U/L、(98.43±5.21)umo

9、l/L、(24.12±1.21)g/;B組為:(4807±244.62)U/L、(5290.67±289.68)U/L、(83.67±3.501)umol/L、(26.33±1.21)g/L;C組分別為:(1946.3±106.87)U/L、(3834.5±230.05)U//L、(102.50±8.24)umol/L、(17.83±1.72)g/L;D組分別為:(1400.5±124.07)U/L、(2985±134.07)U/L、(

10、83±7.61)umol/L、(21.33±1.86)g/L。在移植后36小時、60小時檢測肝功,隨時間推移B、D組肝功指標(biāo)恢復(fù)改善明顯優(yōu)于相應(yīng)對照組。60小時測PT值及腹水均分別優(yōu)于兩對照組(P<0.01);干細(xì)胞移植后60小時后取出肝臟行冰凍切片檢查: A組損傷重、結(jié)構(gòu)破壞明顯,大面積肝細(xì)胞壞死,肝小葉破壞;B組較對照組明顯減輕;C組肝細(xì)胞增生不明顯,伴有炎細(xì)胞浸潤;D組見肝細(xì)胞增生廣泛,肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)明顯。
　　3.表達(dá)GF

11、P示蹤的胎肝干細(xì)胞經(jīng)模型留置管道移植及經(jīng)門靜脈穿刺移植后72小時檢測肝功能數(shù)據(jù)顯示F組ALT、AST分別為(802.83±79.22)U/L、(1463.50±56.22)U/L;G組ALT、AST分別為(827.83±63.08)U/L、(1472.83±52.41)U/L;E組ALT(1275.67±329.59)U/L、(2806.83±157.0)U/L。F組G組兩者間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,但均優(yōu)于對照組。兩者病理學(xué)檢查均提示肝臟體

12、積較對照組有所增大,肝葉代償,鏡下見肝細(xì)胞增生明顯,肝索結(jié)構(gòu)較完整,肝小葉結(jié)構(gòu)較E組有較明顯恢復(fù)。E組病理學(xué)顯示剩余肝葉代償性腫大。鏡下可見肝竇及中央靜脈擴(kuò)張,伴有炎細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞增生不明顯。提示經(jīng)門靜脈分支殘端置管途徑移植FLSPCs治療急性肝損傷性肝衰竭效果等同于經(jīng)門靜脈穿刺途徑。
　　結(jié)論:
　　1.三步分離法提取的胎肝干細(xì)胞具有一定改善急性肝衰竭大鼠的肝功能、凝血及肝臟病理指標(biāo)的作用。
　　2.經(jīng)門靜脈分支殘