燃煤型氟中毒大鼠骺板軟骨組織損傷與TGF-β-Smad傳導(dǎo)通路關(guān)系研究.pdf

1、目的：模擬病區(qū)人群生活情況，復(fù)制燃煤型氟中毒、燃煤型氟中毒伴低蛋白低鈣及燃煤型氟中毒伴高鋁的大鼠模型，動(dòng)態(tài)觀察燃煤型氟中毒大鼠不同時(shí)期骺板軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)改變情況，以及氟對(duì)大鼠軟骨生長(zhǎng)過程中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、大鼠骨成型蛋白2（BMP-2）、大鼠母親DPP同源物4（Smad-4）表達(dá)的影響，探討燃煤型氟中毒大鼠軟骨損傷發(fā)生的可能發(fā)病機(jī)制及伴有低蛋白低鈣、高鋁時(shí)對(duì)軟骨組織損傷的影響。
　　方法：
　　1.將150只斷

2、乳兩周的SD大鼠按體重隨機(jī)分入對(duì)照組、中氟組、高氟組、高氟伴低蛋白低鈣組、高氟伴高鋁組。每組30只（組內(nèi)雌雄各半），分籠喂養(yǎng)，自由飲食，飼料配方如下：
　?。?）對(duì)照組：食用自然曬干玉米加麥麩、大豆粉等制成的飼料（其中玉米所占比例68％，飼料含氟5.2mg/kg，含蛋白質(zhì)0.18Kg/Kg，含鈣8g/Kg），
　?。?）中氟組：食用自然曬干玉米與病區(qū)含氟煤烘干玉米混合后加麥麩、大豆粉等制成飼料（其中病區(qū)含氟煤烘干玉米所占比例

3、30%，自然曬干玉米所占比例38%，飼料含氟47.8mg/kg，含蛋白質(zhì)0.18Kg/Kg，含鈣8g/Kg）。
　?。?）高氟組及高氟伴高鋁組：食用病區(qū)含氟煤烘干玉米加麥麩、大豆粉等制成的飼料（其中病區(qū)含氟煤烘干玉米所占比例68%，飼料含氟96mg/kg，含蛋白質(zhì)0.18Kg/Kg，含鈣8g/Kg）。
　?。?）高氟伴低鈣低蛋白組：食用病區(qū)含氟煤烘干玉米加麥麩、自然曬干玉米等制成的飼料（其中病區(qū)含氟煤烘干玉米占比例68%，自

4、然曬干玉米12%，飼料含氟96mg/kg，含蛋白質(zhì)0.09Kg/Kg，含鈣4g/Kg）。
　　飲水配方如下：
　?。?）對(duì)照組、中氟組、高氟組、高氟伴低蛋白低鈣組飲用自來水（含氟0.699mg/L,含鋁0.2mg/L）。（貴陽市供水總公司）。
　?。?）高氟伴高鋁組飲用自來水（貴陽市供水總公司）加AlCl3（含氟0.699mg/L,含鋁90mg/L）。
　　2．動(dòng)態(tài)觀察各組大鼠染氟期間牙齒的變化情況：每周定時(shí)檢查

5、大鼠氟斑牙情況，根據(jù)對(duì)大鼠氟斑牙分度方法，判定大鼠氟斑牙的嚴(yán)重情況。
　　3．每組30只大鼠均隨機(jī)分成三批，每批10只（雌雄各半），分別于第60天、第120天、第180天處死。處死之前收集24小時(shí)尿液，用于尿氟測(cè)定。取左側(cè)膝關(guān)節(jié)，利用HE染色觀察大鼠的骺板軟骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，測(cè)骺板軟骨厚度、骺板軟骨增值層細(xì)胞數(shù)和肥大層細(xì)胞數(shù)。取右側(cè)膝關(guān)節(jié)，利用酶聯(lián)免疫吸附劑法（ELISA）測(cè)定大鼠軟骨組織SMAD-4、TGF-β1、BMP2的表達(dá)。

6、
　　4．大鼠骨氟、尿氟測(cè)：采用離子選擇電極法、高溫灰化-氟離子選擇電極法測(cè)定大鼠尿氟、骨氟含量
　　結(jié)果：
　　1.大鼠的一般情況
　　實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組精神較好，毛色有光澤，各實(shí)驗(yàn)組大鼠較之對(duì)照組精神較為萎靡，毛色光澤度下降。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組體重增長(zhǎng)較對(duì)照組較為緩慢，在染毒第60天、120天、180天時(shí)高氟伴低蛋白低鈣組體重較對(duì)照組、中氟組、高氟組、高氟伴高鋁組差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05）。
　　2.大鼠

7、氟斑牙檢查及氟斑牙分度方法
　　在染氟第四周，觀察到高氟組、高氟伴低蛋白低鈣組開始出現(xiàn)輕度氟斑牙。在染氟第60d、第120d、第180d，中氟組、高氟組、高氟組伴高氟營(yíng)養(yǎng)不良、高氟伴高鋁組較對(duì)照組氟斑牙發(fā)生率更高（p＜0.05）；在染氟第120d、180d高氟組、高氟組伴高氟營(yíng)養(yǎng)不良、高氟伴高鋁組較中氟組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　　3．大鼠尿氟、骨氟含量
　　在染氟各個(gè)時(shí)期各染氟組大鼠尿氟、骨氟含量均高于對(duì)

8、照組，且高氟組、高氟伴低蛋白低鈣組和高氟伴高鋁組與對(duì)照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；高氟伴低蛋白低鈣組大鼠尿氟、骨氟高于高氟組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；在染毒第120d、180d高氟組尿氟、骨氟濃度高于高氟伴高鋁組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　　對(duì)與同一個(gè)實(shí)驗(yàn)組，隨著染毒時(shí)間增長(zhǎng)，大鼠尿氟、骨氟濃度逐漸增高。
　　4.觀察實(shí)驗(yàn)大鼠軟骨組織病理學(xué)改變
　　（1）大鼠骺板軟骨的組織形態(tài)學(xué)觀察

9、>　　實(shí)驗(yàn)各個(gè)時(shí)期，對(duì)照組大鼠的骺板軟骨邊緣整齊，增值層細(xì)胞縱向堆積成柱，肥大層軟骨細(xì)胞體積較增值層細(xì)胞大，程空泡狀，細(xì)胞核固縮；染氟組與對(duì)照組相比，骺板邊緣不齊，骺板厚度普遍增厚，軟骨細(xì)胞鈣化延遲，增值層和肥大層細(xì)胞層數(shù)增多，高氟伴低蛋白低鈣組骺板增厚，細(xì)胞柱排列紊亂。高氟伴高鋁組增值層軟骨偶爾可見結(jié)節(jié)樣增生；隨染氟時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠骺板組織病變加重，高氟伴低蛋白低鈣組出現(xiàn)大量壞死區(qū)。
　?。?）各組大鼠骺板厚度測(cè)量
　　對(duì)于

10、同一實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)期比較，隨著大鼠飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，所有組別大鼠骺板厚度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。不同時(shí)期三批大鼠各染氟組骺板厚度與對(duì)照組比較均明顯增厚，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著染氟劑量越高，骺板厚度逐漸增厚，三批大鼠高氟組骺板厚度均高于中氟組（P＜0.05）；高氟伴高鋁組大鼠骺板厚度較高氟組低，且在染氟第60d、120d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高氟伴低蛋白低鈣組骺板厚度與高氟組比較無明顯差別。
　?。?）各組大鼠骺板增值層、肥大層細(xì)

11、胞層數(shù)測(cè)量
　　對(duì)于同一組大鼠不同時(shí)期的比較，隨著染氟時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠骺板軟骨組織的增值層細(xì)胞層數(shù)均逐漸降低（p＜0.05）。
　　不同時(shí)期三批大鼠各染氟組骺板增值層、肥大層的細(xì)胞層數(shù)均多于對(duì)照組，且隨著染氟劑量增高細(xì)胞層數(shù)逐漸增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；高氟伴低蛋白低鈣組、高氟伴高鋁組骺板增值層、肥大層細(xì)胞層數(shù)較高氟組均降低。5.各組大鼠骺板組織TGF-β1、BMP-2、Smad-4的表達(dá)
　　對(duì)于同

12、一個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠不同時(shí)期，隨著染氟時(shí)間延長(zhǎng)，各組大鼠骺板組織中TGF-β1、BMP-2、Smad-4含量逐漸降低（p＜0.05）。
　　在各個(gè)染氟同一時(shí)期，各個(gè)染氟組骺板組織中TGF-β1、Smad-4含量均高于對(duì)照組（p＜0.05），且隨染氟劑量增高，大鼠骺板組織中TGF-β1、Smad-4含量逐漸增高；高氟伴低蛋白低鈣組、高氟伴高鋁組骺板軟骨TGF-β1、Smad-4含量均較高氟組低，在染氟60d、180d差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜

13、0.05）。各個(gè)染氟組骺板組織BMP-2含量隨染氟劑量增高有上升趨勢(shì)，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高氟伴低蛋白低鈣組、高氟伴高鋁組骺板軟骨BMP-2含量較對(duì)照組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.本次試驗(yàn)成功復(fù)制了燃煤型氟中毒動(dòng)物模型。
　　2.燃煤型氟中毒大鼠出現(xiàn)了骺板軟骨組織的損傷，主要表現(xiàn)在氟中毒大鼠骺板組織增厚；肥大層、增值層細(xì)胞層數(shù)增多。
　　3.高氟伴低蛋白低鈣組大鼠骺板組