用于耐藥性腫瘤治療的藥物——Pluronic鍵合物混合膠束系統(tǒng)的研究.pdf

1、腫瘤的多藥耐藥性(Multidrug resistance，MDR)是臨床上化療失敗的主要原因之一。迄今，許多抗腫瘤藥物如紫杉烷類、長春堿類和蒽醌類等，在臨床上都出現(xiàn)了多藥耐藥性。目前，開發(fā)具有逆轉(zhuǎn)MDR活性的Pluronic膠束遞藥系統(tǒng)成為治療耐藥性腫瘤的一種新思路。但普通膠束的載藥量低，對耐藥腫瘤的體內(nèi)作用仍不理想。
　　本課題首先選用極易耐藥的甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)為模型藥物，構(gòu)建了以藥物-載體鍵合物(

2、Polymer-drug conjugates)方式載藥的混合膠束(Chemicalconjugation of drug in mixed micelles)，使膠束的載藥量和體內(nèi)外抗MDR腫瘤藥效明顯提高。在研究中發(fā)現(xiàn)，可以直接將親水性藥物鍵合于膠束的載體材料上，同時膠束的疏水內(nèi)核還可以包載難溶性藥物，通過兩種載藥方式結(jié)合可以實現(xiàn)水溶性和疏水性藥物的聯(lián)合給藥，進一步提高膠束載藥量，發(fā)揮藥物協(xié)同作用的優(yōu)勢。為進一步驗證這一構(gòu)想，選用臨

3、床常用的聯(lián)用藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)和紫杉醇(paclitaxel，PTX)為模型藥物，構(gòu)建雙載藥混合膠束系統(tǒng);并將高靶向性的c(RGDyK)肽修飾在混合膠束中F127的PEO鏈上，通過腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞和MDR腫瘤細胞高表達的整合素αvβ3受體介導(dǎo)，增加藥物在腫瘤部位的滲透和蓄積能力，抑制腫瘤新生血管的生成，提高對耐藥腫瘤的治療作用。
　　本文第一部分中，合成了MTX與Pluronic P105的鍵合物P1

4、05-MTX，并與F127制備混合膠束F127/P105-MTX;以及Pluronic P105/F127物理包載MTX的混合膠束PF-MTX，并以膠束的載藥量，包封率和粒徑為考察指標，篩選出了PF-MTX的較優(yōu)處方。結(jié)果顯示，PF-MTX的較優(yōu)處方為P105、F127和MTX的比例為266.7 mg∶33.3 mg∶10 mg，制備的PF-MTX粒徑為22 nm;F127/P105-MTX的載藥量為PF-MTX的3.3倍，粒徑增大，約

5、為100 nm，形態(tài)圓整，大小均一。DSC分析表明MTX以無定形分子或固態(tài)溶液形式分散在共聚物骨架中;F127/P105-MTX比PF-MTX具有更強的緩釋作用，pH5.0條件下比pH7.4更有利于MTX的釋放。Pluronic P105/F127混合膠束具有良好的生物相容性和明顯的MDR腫瘤的治療作用，主要由網(wǎng)格蛋白和陷穴小泡介導(dǎo)的兩種內(nèi)吞途徑入胞后，通過溶酶體轉(zhuǎn)運，需要能量;對于耐長春新堿人口腔上皮癌細胞(KBv)，F(xiàn)127/P10

6、5-MTX比PF-MTX顯示出更強的藥效。
　　本文第二部分中，以KBv為MDR細胞模型，對F127/P105-MTX的作用機理進行研究，通過A-549和KBv細胞攝取與攝取抑制實驗表明，F(xiàn)127/P105-MTX具有葉酸受體的親和性，并且游離葉酸的存在對其攝取具有競爭性作用;體外3D腫瘤球?qū)嶒烇@示F127/P105-MTX比PF-MTX具有更強的MDR實體腫瘤滲透能力和抑制腫瘤球生長的能力;大鼠體內(nèi)藥動學結(jié)果表明，F(xiàn)127/P1

7、05-MTX的AUC0→t是PF-MTX組的2.43倍;體內(nèi)平均滯留時間(MRT)是PF-MTX組的1.34倍;清除率(CL)相對于PF組均顯著降低，比物理載藥膠束延長了藥物的體內(nèi)循環(huán)時間;小動物活體成像實驗證明F127/P105-MTX明顯增加了膠束在體內(nèi)腫瘤部位的蓄積;藥效學實驗表明，F(xiàn)127/P105-MTX比PF-MTX顯示出更顯著的抑制MDR腫瘤的生長的作用，且安全性良好。進一步證實了鍵合方式載藥膠束用于體內(nèi)治療耐藥腫瘤具有可

8、行性。
　　本文第三部分中，選擇了臨床上常用于聯(lián)合給藥治療乳腺癌的兩種藥物DOX與PTX為模型藥物，將DOX鍵合于Pluronic P105兩端，并與F127包載PTX制備得到雙載藥混合膠束PF-DP。以載藥量、包封率和細胞毒性為指標進行篩選，得到載體∶DOX∶PTX的最優(yōu)比例為300 mg∶4 mg∶6mg; PF-DP總載藥量為2.5％，粒徑為25 nm，具有緩釋作用，pH5.0比中性條件下更有利于藥物的釋放。采用人乳腺癌細胞

9、(Michigan Cancer Foundation-7，MCF-7)及其耐藥株(MCF-7/ADR)為細胞模型進行體外研究。細胞攝取和細胞器共定位結(jié)果表明，通過膠束聯(lián)合給藥顯著增加耐藥細胞內(nèi)DOX和PTX的蓄積量，有利于發(fā)揮協(xié)同作用;這個過程需要能量，靠網(wǎng)格蛋白和陷穴小泡介導(dǎo)，受溶酶體酸性影響。細胞周期、細胞凋亡、細胞毒性和3D腫瘤球?qū)嶒灲Y(jié)果表明，DOX與PTX聯(lián)合給藥對于敏感和耐藥腫瘤細胞都顯示出協(xié)同作用，PF-DP對于耐藥腫瘤細

10、胞的毒性顯著強于游離混合藥物(DOX+PTX)。
　　本文第四部分中，采用與腫瘤細胞和新生血管細胞高表達的整合素αvβ3特異性識別并結(jié)合的c(RGDyK)為靶向頭基，表面修飾PF-DP，構(gòu)建c(RGDyK)修飾的雙載藥混合膠束遞藥系統(tǒng)(c(RGDyK)-FP-DP)。理化性質(zhì)表征顯示，該靶向混合膠束與PF-DP相比，粒徑、ζ電位、載藥量和包封率以及體外的釋放行為均沒有發(fā)生顯著變化。以整合素αvβ3受體蛋白高表達的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(

11、Humanumbilical vein endothelial cells，HUVEC)為新生血管模型，考察c(RGDyK)-FP-DP的體外抗血管生成作用。結(jié)果表明，靶向混合膠束顯著增加HUVEC的攝取，這個過程是通過整合素受體介導(dǎo)的，需要能量，穿過HUVEC單層細胞后，可滲透入耐藥腫瘤球較深部位;靶向混合膠束對HUVEC細胞毒性較低，具有抑制微管形成的作用。c(RGDyK)-FP-DP混合膠束對KBv耐藥細胞顯示出高的細胞毒性，增加

12、了細胞攝取;在體內(nèi)外顯示出明顯的KBv腫瘤靶向性。
　　本文第五部分中，以荷KBv皮下瘤裸鼠為模型，對雙載藥混合膠束的組織分布和體內(nèi)藥效學進行考察。結(jié)果顯示，混合膠束明顯改變了藥物在各主要組織器官的分布，減少了藥物在心、肝和脾等正常組織的分布，增加了腫瘤部位的蓄積和血液中的循環(huán)時間。通過c(RGDyK)的修飾，進一步增加了腫瘤組織的藥物量。藥效學實驗表明，c(RGDyK)-FP-DP具有明顯抑制MDR腫瘤生長的作用，顯著延長了荷瘤