支氣管上皮細(xì)胞Shp2對過敏原OVA與LPS誘導(dǎo)的IL-25和哮喘炎癥的調(diào)控作用與分子機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的:
　　支氣管哮喘(asthma)是一種T細(xì)胞控制的，肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞參與的慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病，其特征為氣道炎癥、氣道粘液高分泌和氣道壁重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性和氣流阻塞。而上皮細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的作用今年來的關(guān)注度越來越高。目前公認(rèn)的觀點(diǎn)認(rèn)為支氣管上皮細(xì)胞不僅僅是一層屏障，它們還可以通過模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別環(huán)境中的刺激物，分泌上皮細(xì)胞來源細(xì)胞

2、因子(Epithelium-derived cytokines，EDCs)，橋接了固有免疫和適應(yīng)性免疫。EDCs，包括IL-25、IL-33、TSLP等，與哮喘TH2型免疫反應(yīng)的促進(jìn)和維持相關(guān)。目前，關(guān)于IL-25產(chǎn)生及其機(jī)制的研究較少。研究表明過敏原、空氣傳播的病原體、寄生蟲等可刺激上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-25，而其下游調(diào)控IL-25表達(dá)的相關(guān)因素研究不多。根據(jù)IL-25編碼區(qū)的上游基因序列分析，有學(xué)者推斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(sign

3、al transducer and activator of transcription6，STAT6)、GATA-3、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子可能與IL-25的表達(dá)相關(guān)。然而，上述轉(zhuǎn)錄因子是否在IL-25的誘導(dǎo)機(jī)制中起作用目前尚無相關(guān)的功能性研究。
　　脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為一種病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），廣泛存在于

4、環(huán)境中，尤其是污染的空氣和塵螨中，可被上皮細(xì)胞表面Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）4識(shí)別，通過激活下游絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) p38和c-Jun氮端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）等信號(hào)，導(dǎo)致核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子(nuclear factor kappa-light-chain-enhanc

5、er of activated B cells，NF-kappaB)核易位，進(jìn)而導(dǎo)致前炎癥細(xì)胞因子，包括EDCs的釋放。我們猜想LPS可能誘導(dǎo)了上皮細(xì)胞IL-25的分泌，且該過程依賴于MAPK信號(hào)。
　　Shp2(Src homology2 domain-containing phosphatase2)是一種細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典的蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)，參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)

6、展。Shp2在肺部也廣泛表達(dá)，據(jù)報(bào)導(dǎo)，Shp2調(diào)控了香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞IL-8的高分泌，肺泡上皮Shp2缺失則使得肺泡表面活性物穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致了持續(xù)的肺纖維化。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘氣道重構(gòu)模型中，支氣管上皮細(xì)胞Shp2缺失能下調(diào)TGF-β1表達(dá)，從而抑制哮喘氣道重構(gòu)。然而在哮喘氣道炎癥過程中，Shp2對氣道上皮細(xì)胞其他關(guān)鍵炎癥因子如IL-25等的調(diào)控作用并不清楚。
　　本研究旨在探討支氣管上皮細(xì)胞中Shp2對過敏

7、原雞卵白蛋白(ovalbumin，OVA)及其所含的LPS誘導(dǎo)的IL-25的調(diào)控作用和分子機(jī)制。首先探討了過敏原OVA和LPS誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞炎癥因子IL-25的高表達(dá)及相關(guān)的信號(hào)通路，進(jìn)而研究Shp2在該過程中的調(diào)控作用，并探索其在哮喘動(dòng)物模型中潛在的調(diào)控機(jī)制。
　　材料和方法:
　　體外研究用OVA或LPS刺激人正常細(xì)胞系Beas-2B和原代小鼠氣管上皮細(xì)胞（mouse tracheal epithelial cell

8、s，MTECs），檢測IL-25 mRNA表達(dá)和p38和JNK的活化水平。為驗(yàn)證IL-25的高表達(dá)依賴于p38、JNK和Shp2，采用了相關(guān)抑制劑和siRNA。體內(nèi)研究，首先用C57BL/6小鼠構(gòu)建OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘模型，檢測肺組織中IL-25和IL-33的表達(dá)。其次構(gòu)建了誘導(dǎo)型支氣管上皮細(xì)胞Shp2定向敲除動(dòng)物模型---CC10-rtTA/(tetO)7-Cre/Shp2flox/flox三重雜交小鼠。給予該小鼠強(qiáng)力霉素(Doxy

9、cycline，DOX)誘導(dǎo)Shp2的敲除后用OVA誘導(dǎo)哮喘模型，然后觀察肺組織中IL-25的表達(dá)水平變化，以及受IL-25調(diào)控的TH2型炎癥，包括TH相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，TH細(xì)胞亞群的比例，肺泡灌洗液(Bronchial alveolar lavage fluid，BALF)中嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤情況。
　　研究結(jié)果:
　　大劑量OVA（2 mg/ml，20 mg/ml）和小劑量LPS（100 ng/ml）能夠誘導(dǎo)支氣管上皮

10、細(xì)胞IL-25高表達(dá)（P＜0.05）。大劑量OVA（2 mg/ml，20 mg/ml）和小劑量LPS(100 ng/ml)在Beas-2B細(xì)胞中活化了p38和JNK，但均不能活化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated proteinkinases，ERK）。p38抑制劑SB202190和JNK抑制劑SP600125分別預(yù)處理細(xì)胞后，LPS對IL-25的誘導(dǎo)作用被明顯抑制，兩者同時(shí)預(yù)處理細(xì)胞，LPS對IL-25

11、的誘導(dǎo)幾乎完全被抑制。Shp2抑制劑PHPS-1和Shp2 siRNA均抑制了LPS誘導(dǎo)的IL-25的分泌，且均降低了JNK的活化。OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中，肺組織IL-25 mRNA的表達(dá)明顯增加，且從8小時(shí)(P＜0.001)持續(xù)到24小時(shí)(P＜0.05)以后。然而，CC10-rtTA/(tetO)7-Cre/Shp2flox/flox三重雜交小鼠給予DOX誘導(dǎo)Shp2的敲除后（Shp2△/△）用OVA誘導(dǎo)哮喘模型，與ShpF/F(

12、CC10-rtTA/(tetO)7-Cre/Shp2flox/flox小鼠不給DOX）相比，肺組織中IL-25的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。進(jìn)而我們觀察了受IL-25調(diào)控的TH2型炎癥，發(fā)現(xiàn)與ShpF/F相比，Shp2△/△小鼠肺組織中TH2和TH17細(xì)胞亞群的比例無顯著差異（P＞0.05），TH相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-17、Foxp3的表達(dá)無顯著差異（P＞0.05），BALF中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞比例均無明顯改變（P＞0.