YKL-40調(diào)控支氣管上皮分泌IL-8對支氣管平滑肌細胞增殖和遷移的影響.pdf

1、背景和目的:YKL-40蛋白是一種由Chitinase-3-like-1(CHI3L1)基因編碼的人類甲殼酶樣蛋白(CLP)，又可稱之為人軟骨糖蛋白39(HCgp39)。YKL-40蛋白雖然能夠與甲殼質(zhì)結(jié)合，但是不具備甲殼酶的活性，因此YKL-40蛋白也不具備降解甲殼質(zhì)的能力，其化學結(jié)構(gòu)的N端是由三個氨基酸構(gòu)成，分別為:酪氨酸、賴氨酸和亮氨酸，這三個氨基酸的簡寫分別是Y、K、L，并且恰好蛋白的分子量大小為40千道爾頓(KD)，因此這種蛋

2、白被命名為YKL-40。目前有大量的文獻資料顯示，YKL-40蛋白不但可以在炎癥、組織重構(gòu)以及組織纖維化等病理生理過程中發(fā)揮生物學功能，還可以在實體腫瘤的發(fā)生和進展中同樣扮演很重要的角色。進一步的研究提示，在Th2型的炎癥反應(yīng)中YKL-40的表達明顯增高，這一現(xiàn)象提示YKL-40蛋白和Th2型炎癥之間存在著某種聯(lián)系;除此之外，YKL-40蛋白還具備調(diào)節(jié)基質(zhì)細胞增殖和分化的能力，從而能夠參與到相關(guān)組織的重構(gòu)過程之中，引起一系列相關(guān)的病理變

3、化。前期關(guān)于YKL-40的研究也發(fā)現(xiàn)，與處于哮喘疾病穩(wěn)定期的患者相比，YKL-40蛋白在處于急性發(fā)作期哮喘患者血清中是明顯高表達的，這提示哮喘疾病急性發(fā)作與YKL-40蛋白高表達之間存在著某種相關(guān)性。
　　眾所周知，人的支氣管上皮細胞覆蓋在氣道表層，起到抵御外界刺激物和微生物侵襲的作用，構(gòu)成氣道內(nèi)外環(huán)境的有效屏障;不僅如此，支氣管上皮還能夠在哮喘的發(fā)病、急性發(fā)作及加重的過程中發(fā)揮一定作用，既往的研究通過免疫組化等實驗方法，發(fā)現(xiàn)YK

4、L-40蛋白在哮喘患者支氣管上皮細胞中的表達顯著升高，這提示哮喘患者發(fā)病時，支氣管上皮細胞可能是受到Y(jié)KL-40蛋白的某種影響，從而參與哮喘病程的發(fā)生和發(fā)展。而且目前的研究已經(jīng)證實，氣道組織發(fā)生重構(gòu)是哮喘的重要病理基礎(chǔ)。很多的學者認為在氣道重構(gòu)過程中，不但包括了支氣管平滑肌的數(shù)量和體積發(fā)生改變，還伴隨有支氣管平滑肌位置的改變，即支氣管平滑肌細胞向上皮細胞發(fā)生遷移，基于此種因素導(dǎo)致發(fā)生相應(yīng)的病理變化和臨床表現(xiàn)。
　　本課題的主要研究

5、目的是更深入地了解YKL-40蛋白的功能，探討其如何介導(dǎo)支氣管上皮細胞的炎癥反應(yīng)，驗證YKL-40是否參與了氣道平滑肌細胞增殖和遷移過程，從而更加深入地研究哮喘疾病的發(fā)病機制。
　　方法:體外成功培養(yǎng)兩種支氣管上皮細胞:支氣管上皮永生細胞系（BEAS-2B）和原代人支氣管上皮細胞(HBECs)，用不同濃度的YKL-40蛋白刺激BEAS-2B和HBECs不同時間后，采用熒光定量PCR和ELISA方法檢測上清中含有的趨化因子(IL-8

6、、RANTES、Eotaxin)和細胞因子（TNF-α）的變化。
　　按照實驗要求配制多種濃度(1ng/ml，10 ng/ml，100 ng/ml，1μ g/ml，10μ g/ml)的YKL-40蛋白溶液，依次加入兩種支氣管上皮細胞（BEAS-2B和HBECs）培養(yǎng)瓶內(nèi)，用以分別刺激培養(yǎng)6個小時，然后再次更換兩種上皮細胞的培養(yǎng)基，靜置恒溫箱同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)刺激18小時后，分別收集這兩種上皮細胞培養(yǎng)液上清，并予以詳細標注、命名后待用

7、。BEAS-2B上清液命名為:YKL-40-BEAS-2B-CM;HBECs上清液命名為:YKL-40-HBECs-CM。然后把兩種上清分別加入支氣管平滑肌細胞(BSMCs)培養(yǎng)瓶，用于替代支氣管平滑肌細胞常規(guī)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)刺激。然后在24小時后檢測BSMCs的遷移能力變化，72小時后檢測BSMCs的增殖能力變化。另外，使用免疫沉淀法去除兩種上清(YKL-40-BEAS-2B-CM和YKL-40-HBECs-CM)內(nèi)的IL-8，分別重復(fù)

8、上述實驗步驟，以對照研究IL-8在其中的作用。同時設(shè)立陽性對照組，即在BSMCs常規(guī)培養(yǎng)基內(nèi)加入rhIL-8，得到富含白介素8的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液含有rhIL-8濃度分別為1ng/ml，10ng/ml，20ng/ml。
　　結(jié)果:檢測兩種上清（YKL-40-BEAS-2B-CM和YKL-40-HBECs-CM）內(nèi)各種趨化因子和細胞因子的變化。YKL-40蛋白能以濃度和時間依賴方式增強IL-8的表達和分泌，但對RANTES，Eotaxi

9、n，TNF-α沒有顯著影響。受到兩種上清液YKL-40-BEAS-2B-CM和YKL-40-HBECs-CM的刺激后，BSMCs的增殖能力和遷移能力能夠顯著增強，但兩種上清中的IL-8被去除后，再次用于刺激BSMCs，細胞增殖和遷移能力受到抑制。
　　結(jié)論:YKL-40蛋白能夠調(diào)控支氣管上皮表達和分泌IL-8，并且通過這種調(diào)控能力參與哮喘發(fā)作時的氣道炎癥反應(yīng);YKL-40蛋白能夠增強支氣管平滑肌細胞的增殖和遷移，參與支氣管組織重構(gòu)