在具有高轉(zhuǎn)移傾向的非小細胞肺癌細胞中,+58CpG位點的甲基化能夠降低DCN基因的表達從而增強TGF-β信號通路.pdf

1、目的：肺癌是全世界范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌分非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC);其中NSCLC在所有肺癌中約占85％。由于在實體瘤患者中,90％的癌癥死于轉(zhuǎn)移,因此闡明潛在的肺癌轉(zhuǎn)移機制顯得尤為重要。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是細胞生理過程中普遍存在的、重要的調(diào)節(jié)因子,如調(diào)節(jié)細胞的增殖,遷移,侵襲和免疫監(jiān)視。核心蛋白聚糖(DCN)是存在于細胞外基質(zhì)的、富含亮氨酸的、小分子蛋白聚糖家族的成員。它可以特異地結(jié)合TG

2、F-β并部分阻斷TGF-β的信號傳導途徑,從而抑制遠端腫瘤,包括肺癌在內(nèi)的細胞生長。然而,對于何種機制導致DCN的低表達并促進肺癌的轉(zhuǎn)移尚不清楚。在我們的研究中,我們探討了在轉(zhuǎn)移的NSCLC細胞中,DNA甲基化這一表觀遺傳學因素是否能夠?qū)е翫CN失活并影響TGF-β/Smad信號通路。
　　方法：⑴檢測低轉(zhuǎn)移的95C和高轉(zhuǎn)移的95D非小細胞肺癌細胞的遷移和侵襲能力。⑵以β-actin為內(nèi)參,用q-PCR檢測DCN的表達,驗證DCN

3、的表達是否會隨著細胞轉(zhuǎn)移能力的增強而降低。⑶用濃度為10um的5-Aza去甲基化藥物處理95C和95D細胞。5天后提取細胞DNA和RNA檢測DNA甲基化和DNC基因表達的關(guān)系。⑷選取DCN基因近端啟動子(-200~+1)和5'-UTR(+1~+1,030)共1231bp片段,并用Methyl Primer Express? Software v1.0和TFSEARCH軟件預測含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的CpG位點。⑸用95C、95D細胞和III和

4、IV的非小細胞肺癌病人組織驗證預測的功能性+58CpG位點甲基化與DCN表達之間的關(guān)系。⑹用Western Blot檢測轉(zhuǎn)錄因子AHR在95C和95D細胞中是否表達。⑺在95C和95D細胞中,用ChIP方法分析AHR能否與+58CpG位點結(jié)合。⑻用EMSA以及構(gòu)建熒光素酶報告基因來驗證+58CpG位點甲基化能夠降低 AHR的結(jié)合能力。⑼ELISA實驗檢測DCN蛋白的表達水平。⑽用磷酸化的SMAD3與SMAD3之間的比值以及EMT標記分子

5、E-cadherin來衡量TGF-β通路的活性水平。
　　結(jié)果：①DNA甲基化參與了DCN mRNA的表達。②經(jīng)軟件預測,+58CpG位點是一個潛在的功能性 CpG位點。③在轉(zhuǎn)移的NSCLC細胞中,95D細胞的+58CpG位點甲基化頻率明顯高于95C細胞,而且與DCN的表達具有相關(guān)性。④AHR能夠與DCN基因5′-UTR區(qū)的+58CpG位點結(jié)合。⑤+58CpG位點的甲基化能夠影響轉(zhuǎn)錄因子與DCN基因5′-UTR區(qū)的結(jié)合能力。⑥+5

6、8CpG位點的甲基化能夠抑制熒光素酶報告基因的活性。⑧在轉(zhuǎn)移的NSCLC細胞中,DCN抑制了磷酸化的SMAD3并增強了E-cadherin的表達。
　　結(jié)論：在這項研究中,我們發(fā)現(xiàn)了在高轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌細胞中,DCN基因5'-UTR區(qū)甲基化的+58CpG與DCN mRNA表達降低有關(guān)。我們的研究結(jié)果顯示,+58CpG甲基化可能是導致AHR低招募到DCN5'-UTR區(qū)的機制之一,從而促進TGF-β/Smad信號增強磷酸化Smad3