一種類(lèi)水生雙RNA病毒的分離與文蛤細(xì)胞病理變化研究.pdf

1、文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)是江蘇重要的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)，而文蛤的暴發(fā)性死亡嚴(yán)重阻礙該產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。我們?cè)谙惹暗牟±韺W(xué)及流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大規(guī)模死亡的文蛤體內(nèi)存在一種類(lèi)病毒粒子，該論文對(duì)此病毒粒子的基礎(chǔ)生物學(xué)進(jìn)行研究，探索此病毒與文蛤大規(guī)模死亡之間的聯(lián)系。 運(yùn)用透射電鏡對(duì)異常死亡文蛤的細(xì)胞病理變化及感染的病毒粒子進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)觀察。超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，患病個(gè)體的鰓、消化盲囊、消化道和外套膜中均大量

2、存在一種病毒顆粒，該病毒粒子呈球形，無(wú)囊膜，直徑45～55rim，核心與核衣殼間無(wú)明顯界限，未發(fā)現(xiàn)病毒包涵體。切片結(jié)果顯示，該病毒存在于細(xì)胞間質(zhì)及被破壞的上皮及結(jié)締組織的細(xì)胞質(zhì)中。 通過(guò)差速離心、酒石酸鉀墊超速離心與氯化銫密度梯度離心結(jié)合等方法對(duì)病毒粒子分離純化。比較了蔗糖、酒石酸鉀一甘油與氯化銫三種介質(zhì)密度梯度離心的方法，得出氯化銫密度梯度離心適合該病毒粒子的提純。經(jīng)稱(chēng)量法得到該病毒粒子在氯化銫中的浮密度為1.554～1.58

3、2g/ml。病毒粒子經(jīng)純化后負(fù)染結(jié)果顯示，該病毒粒子呈球形，二十面體對(duì)稱(chēng)，無(wú)囊膜，直徑在60～75nm，表面結(jié)構(gòu)粗糙，殼粒結(jié)構(gòu)比較明顯。同時(shí)運(yùn)用原子力掃描電子顯微鏡(AFM)對(duì)提純病毒粒子進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)該病毒粒子的殼粒結(jié)構(gòu)比較明顯，具有典型的病毒二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。 將提純病毒粒子進(jìn)行(RT)-PCR檢測(cè)，利用已報(bào)道的水生雙RNA病毒通用引物，以病毒核酸(RNA)的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中一對(duì)通用引物編號(hào)為PrBl:

4、5’-gCCgACATCgTCAACTCCAC-3’，PrB2:5'-gACAggATCATCTTggCATA-3’可以擴(kuò)增出文獻(xiàn)所報(bào)道的大小為524bp的目的條帶。初步分析認(rèn)為，該病毒應(yīng)初步定位于水生雙RNA病毒。 另外，通過(guò)差速離心與超微過(guò)濾相結(jié)合的方法得到純凈的病毒液，設(shè)計(jì)該病毒人工感染試驗(yàn)。試驗(yàn)分設(shè)五組，分別為(1)病毒低濃度浸?。?2)病毒高濃度浸?。?3)病毒注射；(4)滅活病毒注射；(5)空白對(duì)照組(未做任何處理)