SIRT1改善老年間充質(zhì)干細(xì)胞衰老和功能及提高心梗療效的研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在組織修復(fù)和再生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，MSCs的衰老隨著年齡增加而增加，這一過(guò)程不但會(huì)損害MSCs在體組織修復(fù)的能力而且會(huì)降低MSCs用于組織再生和細(xì)胞移植的效果。異體移植似乎能解決這一問(wèn)題，但是移植的異體MSCs一旦發(fā)生分化將出現(xiàn)從免疫豁免狀態(tài)向免疫原性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn);更進(jìn)一步講，截至今日沒(méi)有人知道異體干細(xì)胞移植的長(zhǎng)期安全性和有效性。從這個(gè)意義上來(lái)講，年輕來(lái)源的MSCs并非治療老年患者的最佳候選細(xì)胞，所以我

2、們應(yīng)當(dāng)對(duì)年輕MSCs治療年老個(gè)體的疾病持謹(jǐn)慎的態(tài)度。因此，尋找改善老年MSCs衰老表型和功能的策略是很有必要的。然而，如何改善MSCs年齡相關(guān)的生物學(xué)特性至今仍是個(gè)問(wèn)題。我們注意到，NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶SIRT1通過(guò)去乙?；{(diào)節(jié)多種組蛋白和非組蛋白，不僅可以改善細(xì)胞衰老和衰老相關(guān)的疾病，而且對(duì)細(xì)胞代謝、細(xì)胞存活、細(xì)胞血管新生以及細(xì)胞分化等也大有裨益。目前SIRT1對(duì)于MSCs年齡相關(guān)衰老以及功能的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究著重探討SI

3、RT1對(duì)MSCs年齡相關(guān)衰老以及功能優(yōu)化中的作用并探討相關(guān)機(jī)制，進(jìn)而研究這些性能的改善是否可以帶來(lái)治療心肌梗死(MI)的獲益，以期找到一種改善老年MSCs衰老和功能的新靶點(diǎn)。
　　第一部分 SIRT1在間充質(zhì)干細(xì)胞年齡相關(guān)衰老中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究
　　研究目的:本實(shí)驗(yàn)擬研究SIRT1對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)年齡相關(guān)衰老的作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法:
　　(1)比較年輕和年老來(lái)源的MSCs在衰老、增殖以

4、及SIRT1表達(dá)和活性等方面的差異。我們通過(guò)半乳糖苷酶染色來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞衰老;通過(guò)CCK-8試劑盒評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖;通過(guò)熒光定量PCR和western blot檢測(cè)SIRT1表達(dá);借助SIRT1活性檢測(cè)試劑盒來(lái)評(píng)價(jià)SIRT1活性。
　　(2)用慢病毒感染的方式構(gòu)建年輕MSCs SIRT1低表達(dá)模型和年老MSCsSIRT1高表達(dá)模型;借助這兩個(gè)模型評(píng)價(jià)SIRT1與MSCs衰老和增殖之間的因果關(guān)聯(lián);
　　(3)在年輕MSCs SIRT1

5、低表達(dá)模型和年老MSCs SIRT1高表達(dá)模型中用western blot方法評(píng)價(jià)衰老相關(guān)蛋白P16和P21的表達(dá)差異。
　　(4)在年輕MSCs SIRT1低表達(dá)模型和年老MSCs SIRT1高表達(dá)模型中用γ-H2AX免疫熒光染色方法評(píng)價(jià)SIRT1對(duì)DNA損傷的影響，然后通過(guò)γ-H2AX與TRF2的共染情況來(lái)分析DNA損傷是否發(fā)生在端粒部位。
　　(5)在年輕MSCs SIRT1低表達(dá)模型和年老MSCs SIRT1高表達(dá)模

6、型中用熒光定量PCR或者端粒酶活性檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)表達(dá)、端粒酶活性以及端粒長(zhǎng)度的差異。
　　(6)在年輕MSCs SIRT1低表達(dá)模型和年老MSCs SIRT1高表達(dá)模型中用熒光定量PCR或者western blot方法研究端粒保護(hù)蛋白復(fù)合體（shelterin）的表達(dá)差異，以明確SIRT1對(duì)shelterin的調(diào)控作用。
　　研究結(jié)果:
　　(1)較之年輕來(lái)源的MSCs，年老來(lái)源MSCs的衰老

7、顯著增加而增殖明顯減低，與此同時(shí)SIRT1表達(dá)和活性均明顯減低。
　　(2)下調(diào)年輕來(lái)源MSCs的SIRT1表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老而抑制細(xì)胞增殖;上調(diào)老年來(lái)源MSCs的SIRT1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞衰老表型并促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　(3)下調(diào)年輕來(lái)源MSCs的SIRT1表達(dá)可增加P16和P21的表達(dá);上調(diào)老年來(lái)源MSCs的SIRT1表達(dá)可減少P16和P21的表達(dá);
　　(4)下調(diào)年輕來(lái)源MSCs的SIRT1表達(dá)可增加端粒部位的DNA

8、損傷;上調(diào)老年來(lái)源MSCs的SIRT1表達(dá)可減少端粒部位的DNA損傷;
　　(5)下調(diào)年輕來(lái)源MSCs的SIRT1表達(dá)可明顯地減少TERT的表達(dá)進(jìn)而下調(diào)端粒酶的活性;上調(diào)老年來(lái)源MSCs的SIRT1表達(dá)可顯著地增加TERT的表達(dá)進(jìn)而上調(diào)端粒酶的活性。年輕或者年老的MSCs在慢病毒感染的早期（8代以內(nèi)）端粒長(zhǎng)度未受到SIRT1明顯影響。
　　(6)下調(diào)年輕來(lái)源MSCs的SIRT1表達(dá)可明顯地減少shelterin關(guān)鍵組分三肽基

9、肽酶1(TPP1)的表達(dá);上調(diào)老年來(lái)源MSCs的SIRT1表達(dá)可顯著地增加TPP1的表達(dá)。
　　研究結(jié)論:SIRT1通過(guò)誘導(dǎo)TPP1表達(dá)，增加端粒酶活性和減少DNA損傷從而減輕年齡相關(guān)的MSCs衰老。
　　第二部分 SIRT1通過(guò)減輕細(xì)胞衰老、提高促血管新生潛能和應(yīng)激反應(yīng)能力進(jìn)而增強(qiáng)老年來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死的療效
　　研究目的:在本研究中，我們擬評(píng)價(jià)過(guò)表達(dá)SIRT1是否可以改善老年間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)衰老表

10、型和功能進(jìn)而提高老年MSCs治療心肌梗死(MI)的效果。
　　研究方法和結(jié)果:60只左前降支冠脈被結(jié)扎的雌性SD大鼠隨機(jī)接受心肌內(nèi)注射DMEM(DMEM組)，空載質(zhì)粒修飾的老年雄性MSCs(vector-aged MSCs)和SIRT1過(guò)表達(dá)的老年雄性MSCs（SIRT1-aged MSCs組）治療。那些接受開(kāi)胸手術(shù)而不結(jié)扎冠脈也不進(jìn)行其他干預(yù)的20只雌性SD大鼠被作為對(duì)照（sham組）。細(xì)胞移植后1天和3天，我們通過(guò)檢測(cè)Y染色體

11、特異性的sry基因表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞在缺血情況下的存活和定植。我們發(fā)現(xiàn)，SIRT1-aged-MSCs組的sry基因表達(dá)在細(xì)胞移植后1天和3天時(shí)分別是vector-aged MSCs組的五倍和兩倍。細(xì)胞移植28天以后，我們通過(guò)經(jīng)胸心臟超聲檢查和血流動(dòng)力學(xué)檢查評(píng)價(jià)心臟功能;通過(guò)Masson染色評(píng)價(jià)心臟間質(zhì)纖維化;通過(guò)心肌梗死周邊區(qū)CD31和α-SMA免疫熒光染色來(lái)評(píng)價(jià)血管新生情況。我們的結(jié)果表明，vector-aged MSCs治療組的心臟超

12、聲參數(shù)和血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)與DMEM組相比較無(wú)明顯差異，而SIRT1-aged MSCs治療組的心臟超聲參數(shù)(LVEDD、 LVESD、LVEF和LVFS)和血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)(LVSP、LVEDP、dP/dtmax和dP/dt min)較之DMEM組明顯改善。與此結(jié)果相對(duì)應(yīng)，雖然vector-aged MSCs組和SIRT1-aged MSCs組的間質(zhì)纖維化較之DMEM組都有減少，但是只有SIRT1-aged MSCs治療組的減少達(dá)到了明顯的

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SIRT1-aged MSCs治療組心肌梗死周邊區(qū)的血管密度無(wú)論較之DMEM組還是vector-aged MSCs組都顯著增加，但是vector-aged MSCs組與DMEM組之間無(wú)明顯差異。此外，我們還在體外評(píng)價(jià)了SIRT1過(guò)表達(dá)對(duì)于老年MSCs衰老（見(jiàn)“第一部分”）、促血管生成能力和應(yīng)激反應(yīng)的影響。我們通過(guò)分析來(lái)自SIRT1過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組的上清液對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在Matrigel上的血管生成能力評(píng)價(jià)MS

14、Cs的促血管新生能力;在H2O2誘導(dǎo)的MSCs損傷模型上評(píng)價(jià)SIRT1對(duì)于MSCs應(yīng)激反應(yīng)的影響。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)SIRT1的老年MSCs細(xì)胞衰老減輕（見(jiàn)“第一部分”），促血管生成能力增強(qiáng)，而且抗應(yīng)激能力也明顯增強(qiáng)。促血管生成能力增強(qiáng)與促血管生成素-1(Ang1)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)增加和血管內(nèi)皮抑制因子-1(TBS1)減低有關(guān);抗應(yīng)激能力的增強(qiáng)可能與Bcl-2/Bax比值在蛋白水平增加有關(guān)。
　　研究結(jié)論:在老年