Catheps in V作為保護組織損傷-抗炎新型靶點的前期機制.pdf

1、背景:胞外的雙硫鍵HMGB1(高遷移率族蛋白B1)是一種關鍵的損傷相關模式分子DAMP，在眾多急慢性疾病中，通過細胞表面Toll樣受體4(TLR4)介導病理性炎癥:HMGB1-TLR4信號通路的特異性抑制劑可以選擇性阻斷內源性炎癥激活的早期事件，為相關炎癥性疾病提供新的治療藥物?；贖MGB1-TLR4-TNF-α信號軸的細胞高通量篩選發(fā)現(xiàn)，第一代HIV蛋白酶抑制劑Saquinavir(SQV)可有效阻斷HMGB1-TLR4激活后的炎癥

2、因子（TNF-α和IL-6）釋放。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)SQV預處理能顯著減輕肝臟熱缺血再灌注模型（Liver Ischemia/Reperfusion Injury,IR）的肝損傷，而HMGB1-TLR4信號通路正是Liver IR模型的核心通路之一，同時鑒定到半胱氨酸蛋白酶V(Cathepsin V CTSV)是SQV的哺乳動物靶點之一。而細胞實驗與體外重組蛋白實驗均證實CTSV與TLR4存在相互作用且可被SQV阻斷，CTSV低表達致使H

3、MGB1-TLR4激活受限，揭示CTSV在TLR4信號通路中的未知作用，提示SQV通過靶向CTSV而干預HMGB1-TLR4信號軸及其介導疾病。
　　目的:本研究中，我們擬深入探究CTSV與TLR4相互作用的實質及其在TLR4信號通路中的作用機制，同時全面評估SQV抑制HMGB1-TLR4信號通路和保護動物炎癥模型的具體機制，為開發(fā)CTSV為新型抗炎靶點和擴大SQV適應癥提供實驗基礎。。
　　方法:以SQV和另一種已知的CT

4、SV抑制劑SID26681509(SID)為靶向CTSV的藥物探針，分別評估SQV/SID對TLR4信號通路受體水平的早期事件（配體-受體結合、受體二聚化、TLR4-MyD88和TLR4-TRIF活化）以及下游公共通路即NF-κB水平的影響，以期在TLR4信號通路中定位CTSV。同時分別評估CTSV低表達和SQV/SID抑制CTSV對其它模式識別受體(TLR1/2、TLR3、IL-1R)介導信號通路的影響，與前一部分內容相互佐證。運用點

5、突變結構域變異體的方法探究CTSV與TLR4相互作用所涉及的結構域，決定CTSV蛋白酶活性是否參與TLR4信號通路，明確SQV抑制CTSV的具體機制。同時觀察SQV預處理對SQV保護肝臟缺血再灌注模型的必要性，以評估CTSV抑制劑用于臨床情況的可行性。
　　結果:我們發(fā)現(xiàn)SQV在受體水平特異性抑制TLR4介導的MyD88-IRAK4/1活化和TRIF-IRF3的活化，而在NF-κB水平非特異性地抑制TLR1/2、3、4和IL-1R

6、以及TNFR引起的NF-κB活化或TNF-α釋放。SID作為特異性CTSV抑制劑同樣具有上述特性。而CTSV低表達可造成MyD88依賴性的TLR1/2、TLR4下游TNF-α生成減少，但對TRIF依賴性的TLR3通路無影響。在相同濃度時SQV抑制TLR4-MyD88-IRAK1激活的程度強于SID，與兩者在阻斷CTSV-TLR4相互作用的強弱趨勢一致，與兩者在抑制CTSV蛋白酶活性的強弱趨勢相反。同時，酶活性減低的CTSV變異體（酶結構

7、域變異體C138S，N端糖基化變異體N292Q）依舊可與TLR4相互作用。此外，僅在灌注期給予SQV依舊可以保護HMGB1-TLR4介導的肝臟缺血再灌注損傷。
　　結論:本研究進一步確定Cathepsin V是FDA認證藥物HIV蛋白酶抑制劑SQV特異性拮抗HMGB1-TLR4介導炎癥的新型靶點，并揭示CTSV參與TLR4受體水平對MyD88的募集，而SQV的作用方式很可能是直接阻斷CTSV與TLR4的相互作用。同時發(fā)現(xiàn)了SQV和