放射性腸干細(xì)胞損傷體外模型的建立和抗放靶點(diǎn)的初步篩選.pdf

1、背景和目的：
　　在臨床盆腹腔腫瘤治療中，放射治療是一個(gè)重要手段，但其副反應(yīng)如放射性腸炎等明顯影響患者生存質(zhì)量，限制了放射有效劑量的使用，且尚無有效的治療手段[1，2]。核恐怖襲擊、突發(fā)核電站泄漏等均可造成急性放射病，包括腸型和骨髓型。短時(shí)間內(nèi)大量的急性放射病患者給臨床救治和護(hù)理工作帶來極大的挑戰(zhàn)。
　　目前放射性腸損傷的體外模型多依賴于2D培養(yǎng)的永生化前體細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系，這些細(xì)胞系不能較好地模擬在體小腸干細(xì)胞的生理功能

2、和特性，并且多存在一些基因突變，對(duì)射線的敏感性弱。小腸干細(xì)胞(Intestinal stem cells)位于隱窩基底部，目前認(rèn)為包括穿插于潘氏細(xì)胞之間的基底柱狀細(xì)胞（Lgr5干細(xì)胞）和位于Paneth細(xì)胞位置以上的表達(dá)較低Lgr5水平的相對(duì)靜止的干細(xì)胞。干細(xì)胞增殖分裂后的子代細(xì)胞沿隱窩-絨毛軸遷移、分化和衰老，到達(dá)絨毛項(xiàng)部后自動(dòng)脫落于腸腔。電離輻射可誘導(dǎo)隱窩細(xì)胞發(fā)生一系列快速變化:對(duì)放射敏感的Lgr5干細(xì)胞快速死亡，存活的干細(xì)胞和一些

3、重新獲得干性的細(xì)胞在周期阻滯后重新進(jìn)入細(xì)胞周期完成隱窩-絨毛的結(jié)構(gòu)重建。這些在體的隱窩細(xì)胞的損傷和修復(fù)動(dòng)力過程是2D培養(yǎng)模型不能模擬的，然而體外培養(yǎng)難題阻礙了對(duì)干細(xì)胞的研究和臨床應(yīng)用。
　　2009年，Hans Clevers實(shí)驗(yàn)室成功實(shí)現(xiàn)了腸干細(xì)胞的體外3D培養(yǎng)，通過基質(zhì)膠Matrigel提供細(xì)胞的基質(zhì)支持;添加調(diào)控關(guān)鍵信號(hào)通路的關(guān)鍵因子模擬在體的重要信號(hào)通路;模擬體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境，實(shí)現(xiàn)了隱窩干細(xì)胞在體外長期培養(yǎng)，并形成類器官樣

4、結(jié)構(gòu)，為小腸干細(xì)胞的研究提供了全新的平臺(tái)。為了解決輻照損傷修復(fù)所面臨的小腸干細(xì)胞數(shù)量、干細(xì)胞增殖能力等問題，研究者們將目光投向了各種細(xì)胞因子、小分子化合物等領(lǐng)域。但是部分細(xì)胞因子和小分子化合物在體實(shí)驗(yàn)需要量大、成本高，體外篩選平臺(tái)的建立提供了研究此類小分子化合物的便利。本實(shí)驗(yàn)先后建立體外腸干細(xì)胞放射性損傷模型，建立篩選平臺(tái)，在此基礎(chǔ)上對(duì)一些針對(duì)干細(xì)胞本身和可能針對(duì)微環(huán)境的一些細(xì)胞因子和小分子化合物進(jìn)行初步的篩選，結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)抗放靶點(diǎn)進(jìn)

5、行初步篩選和區(qū)分，為研究臨床治療和護(hù)理工作中減輕腫瘤放療腸道損傷的副作用的新措施提供新的平臺(tái)和線索。
　　方法：
　　1.放射性腸損傷體外模型的建立
　　分別分離C57BL/6（野生型）、P53-/-小鼠小腸隱窩，于基質(zhì)膠內(nèi)接種24h、48h、72h后分別給予X射線4～10Gy照射。顯微鏡下觀察隱窩的形態(tài)學(xué)改變，比較兩組隱窩克隆出芽過程;MTT染色后計(jì)數(shù)相同基因型小鼠隱窩在接受不同輻照劑量，照后不同時(shí)間點(diǎn)克隆存活率。對(duì)

6、接種24h給予6Gy輻照后的野生型小鼠隱窩，通過RT-PCR檢測照后24h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)不同靶基因的表達(dá)。檢測基因包括Bax、Bbc3、Mdm2、P21、Bcl2l1等P53靶基因以及Lgr5、Olfm4、Ascl2等小腸干細(xì)胞特征性基因的表達(dá)。
　　2.利用細(xì)胞分子IL22、小分子化合物Dmog、FingolimodHC1（鹽酸芬戈莫得）對(duì)體外放射性腸損傷模型篩選的細(xì)胞因子和小分子化合物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行初步篩選
　　野生型小鼠

7、隱窩于接種48h給予6Gy輻照，建立體外放射性腸損傷模型。分別于輻照后6h給予不同濃度的Dmog，輻照前3h給予不同濃度的IL22或者鹽酸芬戈莫得。顯微鏡下觀察隱窩的形態(tài)學(xué)改變，并于輻照后5d計(jì)算各組隱窩存活率。另外，在IL22用藥后不同時(shí)間點(diǎn)提取隱窩總RNA，通過RT-PCR檢測照后24h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)小腸干細(xì)胞特征性基因Lgr5及P53靶基因的相對(duì)表達(dá)量變化。
　　建立全身輻照的放射性腸損傷小鼠模型，于輻照后24h腹腔注射8mg

8、/kg/d的Dmog、輻照前1h腹腔注射不同濃度的鹽酸芬戈莫得。輻照后每天觀察小鼠體重，精神狀態(tài);10Gy輻照的小鼠于輻照后84h取材，12Gy輻照的小鼠于輻照后96h取材;采集大體觀察圖片，肉眼觀察小腸腸管的充盈程度，腸內(nèi)容物和腸壁厚薄以判斷腸損傷程度;HE病理染色小腸組織，觀察小腸隱窩的缺失和絨毛的完整性;Brdu染色增殖隱窩，判斷小腸隱窩的增殖情況。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，初步區(qū)分細(xì)胞因子及小分子化合物的作用靶

9、點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1.正常培養(yǎng)的隱窩能較好模擬在體情況;接種24h隱窩呈圓球形，48～72h隱窩出芽，形成“囊腔”，表現(xiàn)出體內(nèi)隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)。C57BL/6小鼠隱窩在接種24h接受6Gy輻照，照后24h隱窩內(nèi)出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡，出芽完全被抑制;P53-/-小鼠隱窩仍繼續(xù)出芽，存活率顯著高于野生型小鼠隱窩(P＜0.01)。C57BL/6小鼠隱窩提取RNA，RT-PCR結(jié)果顯示:P53通路下游基因在輻射后迅速激活，表達(dá)量增高;

10、而干細(xì)胞的標(biāo)記基因在輻照后迅速下降，24h達(dá)到最低水平。提示此模型能較好地模擬在體P53依賴的腸干細(xì)胞輻射損傷修復(fù)過程。
　　2.C57BL/6小鼠隱窩接種48h，6Gy輻照后6h給予不同濃度的Dmog，對(duì)照組隱窩存活率為（49±4）％;200μM組隱窩存活率為（57±5）％;500μM組隱窩存活率為（56±5）％;1000μM組隱窩存活率為（60±7）％。1000μM組存活率高于對(duì)照組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL22于

11、輻照前3h給藥，1ng/ml組隱窩存活率為（69±7）％;3ng/ml組隱窩存活率為（82±9）％;5ng/ml組隱窩存活率為（85±7）％;10ng/ml組隱窩存活率為（60±5）％。不同濃度IL22處理組與對(duì)照組比，P值均＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鹽酸芬戈莫得于輻照前3h給藥，0.5μM組隱窩存活率為（52±10）％;1μM組隱窩存活率為（71±5）％;2μM組隱窩存活率為（20±6）％;4μM組隱窩存活率為（11±2）％。1μ

12、M組隱窩存活率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.C57BL/6小鼠在接受10Gy或者12Gy輻照前后，給予不同藥物處理后取材(10Gy輻照后84h、12Gy輻照后96h):Dmog用藥組:小腸腸腔充盈，內(nèi)含大量黃色粘液，肉眼觀腸壁變薄，與對(duì)照組差異不明顯。5mg/kg/d的鹽酸芬戈莫得用藥組與對(duì)照組相比較能明顯減輕腸腔腫脹，減少小腸內(nèi)黃色粘液，肉眼觀腸壁較對(duì)照組厚;HE染色顯示（用藥組相較于對(duì)照組）:小腸

13、上皮絨毛結(jié)構(gòu)完整，隱窩結(jié)構(gòu)較完整且數(shù)量多，隱窩內(nèi)細(xì)胞多;Brdu染色結(jié)果:用藥組陽性染色細(xì)胞較對(duì)照組多，增殖隱窩數(shù)明顯多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.建立基于3D小鼠小腸隱窩培養(yǎng)的體外放射性腸干細(xì)胞損傷模型，證實(shí)3D培養(yǎng)小腸干細(xì)胞對(duì)P53依賴的細(xì)胞死亡和周期阻滯、有絲分裂災(zāi)難等行為和體內(nèi)的一致性。
　　2.IL22可以作為針對(duì)腸干細(xì)胞的輻射保護(hù)劑體外篩選的陽性對(duì)照;3D腸干細(xì)胞體外輻