動脈粥樣硬化易損斑塊破裂炎癥靶點探索與抗炎干預(yù)研究.pdf

1、動脈粥樣硬化（AS）性疾病是全球范圍內(nèi)發(fā)病和死亡人數(shù)最多的疾病，大約75％心肌梗死患者是由病變冠脈的不穩(wěn)定斑塊破裂繼發(fā)血栓形成引起。二十世紀(jì)，脂質(zhì)浸潤學(xué)說為AS發(fā)病機制的主流學(xué)說。以他汀類藥物為代表的降脂藥顯著降低了AS患者主要不良心血管事件（MACE），但對他汀為基石的治療方案的二級預(yù)防效果進(jìn)行薈萃分析發(fā)現(xiàn)5年內(nèi)MACE的發(fā)生風(fēng)險仍高達(dá)21%。目前認(rèn)為，動脈粥樣硬化是一種由脂質(zhì)和炎癥共同驅(qū)動的慢性進(jìn)展性疾病，他汀的剩余風(fēng)險與目前AS抗

2、炎治療不足有關(guān)。因此，探索有前途的AS炎癥靶點，尤其是發(fā)現(xiàn)與斑塊破裂密切相關(guān)的靶點并對其進(jìn)行有效的干預(yù)治療有望進(jìn)一步減少動脈粥樣硬化病人的不良心血管事件的發(fā)生。
　　應(yīng)用能模擬人體動脈粥樣硬化易損斑塊破裂的動物模型對有潛在治療價值的靶點進(jìn)行在體驗證，是判定候選靶點價值性的有效手段。本課題組自主創(chuàng)立了“聯(lián)合部分結(jié)扎左腎動脈，左頸總動脈誘導(dǎo)ApoE-KO小鼠頸動脈斑塊破裂”模型（以下簡稱R+C模型），是到目前為止易損斑塊破裂發(fā)生率最高

3、(80%)的動物模型。
　　本課題擬利用R+C模型對在動脈粥樣硬化易損斑塊破裂中發(fā)揮重要作用的炎癥靶點進(jìn)行在體探索，并進(jìn)一步行抗炎干預(yù)研究。首先,研究R+C模型對他汀治療的反應(yīng)性，以評估其作為抗動脈粥樣硬化藥物研發(fā)干預(yù)平臺的價值。其次，研究核受體Nur77，RXRα在巨噬細(xì)胞的亞細(xì)胞定位與炎癥激活的關(guān)系，并利用Nur77基因敲除小鼠觀察其對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展尤其是斑塊穩(wěn)定性的影響。最后應(yīng)用RXRα拮抗劑K-80003觀察這一新的

4、抗炎藥物的治療價值并對其安全性進(jìn)行評估。總之，本課題探索在易損斑塊破裂中發(fā)揮重要作用的分子機制與炎癥靶點，并進(jìn)行初步干預(yù)研究，為從抗炎角度開發(fā)抗動脈粥樣硬化藥物提供新思路和新依據(jù)。
　　第一部分、他汀通過調(diào)控趨化因子和趨化因子受體發(fā)揮抗炎與穩(wěn)定斑塊的作用
　　目的：理想的動物疾病模型須對在人類治療有效的藥物具備一致的反應(yīng)性。他汀類藥物通過抗炎和穩(wěn)定斑塊發(fā)揮心血管保護作用，我們觀察阿托伐他汀（10mg/kg/day）在不影響血

5、脂水平的情況下對R+C模型易損斑塊的影響。并深入研究他汀穩(wěn)定斑塊作用的抗炎機制。
　　方法：8-10周齡雌性ApoE-/-小鼠共30只，應(yīng)用R+C的造模方法誘導(dǎo)頸動脈易損斑塊形成，所有小鼠隨機分為兩組：對照組（給予生理鹽水）和阿托伐他汀組（10mg/Kg.d），每日灌胃給藥，持續(xù)8周后取材，制作左頸總動脈病理切片分析阿托伐他汀對斑塊面積、斑塊形態(tài)，斑塊成份、膠原酶活性以及趨化因子表達(dá)水平的影響；流式細(xì)胞法分析他汀對小鼠外周血單核細(xì)

6、胞趨化因子受體表達(dá)；分離血漿檢測兩組血脂水平及炎癥因子水平。
　　結(jié)果：(1)與對照組相比，阿托伐他汀組易損斑塊檢出率明顯減少，但對斑塊負(fù)荷無影響；(2)阿托伐他汀明顯減少巨噬細(xì)胞浸潤以及脂質(zhì)在內(nèi)膜下沉積，并增加斑塊中膠原蛋白含量、降低膠原蛋白酶活性和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達(dá)；(3)阿托伐他汀下調(diào)斑塊中趨化因子MCP-1，CX3CL1表達(dá)以及外周血單核細(xì)胞表面趨化因子受體CCR2、CX3CR1的表達(dá)；(4)血漿炎癥標(biāo)志物hs

7、-CRP和TNF-α在阿托伐他汀組小鼠明顯降低，兩組小鼠總膽固醇、甘油三酯水平無差異。
　　結(jié)論：(1) R+C模型在阿托伐他汀干預(yù)下，斑塊趨于穩(wěn)定并且炎癥水平下調(diào)；R+C模型是一個較為理想的研究動脈粥樣硬化易損斑塊破裂機制與治療手段的模式動物平臺。(2)他汀可通過調(diào)控趨化因子及其受體表達(dá)減輕巨噬細(xì)胞在粥樣硬化斑塊內(nèi)浸潤從而發(fā)揮心血管保護作用。
　　第二部分、核受體Nur77在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究
　

8、　目的：核受體Nur77是一種在動脈粥樣硬化中起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。近幾年發(fā)現(xiàn)Nur77在某些病理生理狀態(tài)下發(fā)生核漿穿梭，在細(xì)胞漿發(fā)揮重要的“非轉(zhuǎn)錄依賴型功能”。本部分探討在不同炎癥狀態(tài)的AS病變中Nur77在巨噬細(xì)胞中的定位，明確Nur77核漿定位與炎癥的關(guān)系；并利用Nur77基因敲除小鼠觀察其對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展尤其是斑塊穩(wěn)定性的影響。
　　方法：分別在不同炎癥程度的動脈粥樣硬化斑塊中行Nur77和巨噬細(xì)胞免疫熒光共染，

9、明確Nur77核漿定位與炎癥程度的關(guān)系。選取同窩Nur77+/+ApoE-/-（ApoE組）與Nur77-/-ApoE-/-（DKO組）小鼠，行R+C造模，分別于1W、2W、6W、8W頸動脈取材，制作病理切片。分析兩組在不同病變階段斑塊面積，斑塊表型，斑塊成份的差異。
　　結(jié)果：(1)在人和小鼠動脈粥樣硬化病變中都證明：在早期階段，炎癥程度較輕，Nur77定位于核內(nèi)，而在炎癥活躍的易損斑塊，Nur77大量出核。這提示Nur77出核

10、與炎癥加劇密切相關(guān)。(2)應(yīng)用基因敲除小鼠對Nur77的作用進(jìn)行在體研究，發(fā)現(xiàn)在斑塊早期階段（1w+2w取材組），兩組間斑塊面積、斑塊形態(tài)分析都沒有差異。而在斑塊急速進(jìn)展成易損斑塊并伴有高比例斑塊破裂的6w+8w組，Nur77敲除后不穩(wěn)定斑塊，斑塊出血，斑塊破裂，斑塊破裂伴腔內(nèi)血栓的比例顯著下降，斑塊趨于穩(wěn)定，斑塊負(fù)荷顯著減小。(3)對兩組晚期病變進(jìn)行斑塊成份分析，發(fā)現(xiàn)Nur77敲除后平滑肌細(xì)胞顯著增加，膠原酶表達(dá)顯著減少，膠原含量增加

11、。此外，巨噬細(xì)胞和斑塊脂質(zhì)含量都有下降的趨勢。
　　結(jié)論：(1)動脈粥樣硬化斑塊巨噬細(xì)胞中Nur77的胞漿定位與炎癥程度加劇密切相關(guān)；(2) Nur77胞漿定位促使斑塊易損性顯著增加以及斑塊破裂的發(fā)生，是一個很好的穩(wěn)定斑塊的抗炎干預(yù)靶點。
　　第三部分RXRα拮抗劑K-80003的抗炎與穩(wěn)定斑塊作用研究
　　目的：RXRα在動脈粥樣硬化發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，經(jīng)特殊修飾的舒林酸衍生物K-80003無COX抑制效應(yīng)

12、而具有對RXRα的高度親和力。本部分探討RXRα拮抗劑 K-80003對動脈粥樣硬化尤其是斑塊穩(wěn)定性的影響，并評價其抗炎效應(yīng)及安全性，明確其臨床應(yīng)用價值。
　　方法：8-10周齡雌性ApoE-/-小鼠R+C方法造模誘導(dǎo)頸動脈易損斑塊形成，所有小鼠隨機分為兩組：對照組和K-80003組（15mg/Kg.d）。每日灌胃給藥，4w，8w后取材，分析K-80003對斑塊面積、斑塊形態(tài)，斑塊成份、膠原酶活性的影響；分析K-80003對斑塊局

13、部以及全身炎癥狀態(tài)的影響；最后對其安全性進(jìn)行評價。
　　結(jié)果：(1)易損斑塊巨噬細(xì)胞中RXRα的胞漿定位與炎癥加劇密切相關(guān)；K-80003干預(yù)后斑塊負(fù)荷顯著減輕，斑塊趨于穩(wěn)定；(2)對斑塊成份分析發(fā)現(xiàn)：K-80003顯著減低巨噬細(xì)胞和脂質(zhì)沉積，并且增加平滑肌細(xì)胞含量，降低膠原酶活性與MMPs的表達(dá)，使膠原含量增加；(3) K-80003抑制斑塊NF-κB激活與TNF-α，IL-6，MCP-1的表達(dá)，降低血漿hs-CRP，TNF-α

14、的水平。(4) K80003給藥后對小鼠血脂，肝功，腎功均無影響，COX途徑未受影響。
　　結(jié)論：(1) RXRα是一個潛在的易損斑塊破裂抗炎治療靶點；(2) RXRα拮抗劑K-80003通過調(diào)控斑塊局部與系統(tǒng)性炎癥水平，從而發(fā)揮抗AS以及穩(wěn)定斑塊的作用；(3) K-80003無COX抑制效應(yīng)，對小鼠脂質(zhì)代謝，肝腎功能亦無影響，安全有效，具有光明的臨床應(yīng)用前景。
　　總結(jié)：
　　本課題利用動脈粥樣硬化人體標(biāo)本以及自主構(gòu)

15、建的“動脈粥樣硬化易損斑塊破裂”動物模型，對Nur77亞細(xì)胞定位與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行在體研究，并對RXRα拮抗劑K-80003的臨床應(yīng)用價值進(jìn)行評價，此外探討他汀類藥物抗炎作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1) R+C模型在阿托伐他汀干預(yù)下，斑塊趨于穩(wěn)定并且炎癥水平下調(diào)；R+C模型是一個較為理想的研究動脈粥樣硬化易損斑塊破裂機制與治療手段的模式動物平臺。阿托伐他汀可通過調(diào)控趨化因子及其受體表達(dá)減輕巨噬細(xì)胞在粥樣硬化斑塊內(nèi)浸潤而發(fā)揮抗炎與