BDNF-PTD融合蛋白逆轉(zhuǎn)大腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)死亡的藥效學(xué)和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 血腦屏障主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞和腦組織的星狀膠質(zhì)細(xì)胞的足突構(gòu)成,具有內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接并且缺乏內(nèi)吞囊的特點(diǎn),可限制血液和腦組織之間物質(zhì)的自由交換,因此大多數(shù)藥物很難通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦發(fā)揮治療疾病作用。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)為生物體內(nèi)天然的蛋白分子,在神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育中,對(duì)神經(jīng)元的生存,分化起重要作用；具有增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶等功能,但同樣難以

2、通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療神經(jīng)退行性疾病。目前臨床上缺少一種有效的,非侵入性的方法使得BDNF通過(guò)血腦屏障而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),因而限制了BDNF在臨床上的應(yīng)用。所以,以何種給藥系統(tǒng)使BDNF進(jìn)入大腦是發(fā)揮BDNF臨床治療作用應(yīng)用的關(guān)鍵。目前在實(shí)驗(yàn)室階段研究的腦靶向給藥系統(tǒng)主要包括:
　　 ①腦血管內(nèi)灌注或腦內(nèi)直接注射給藥。
　　 ②病毒載體介導(dǎo)基因后的腦內(nèi)直接注射給藥。
　　 ③脂質(zhì)體包裹藥物后系統(tǒng)途徑給藥。

3、
　　 ④腦靶向單克隆抗體偶聯(lián)藥物后系統(tǒng)途徑給藥。
　　 但這些方法有很多的不足:
　　 ①腦血管內(nèi)灌注或腦內(nèi)注射給藥有極大的不順應(yīng)性,且給藥后,藥物分布在很小的腦部位。
　　 ②病毒基因介導(dǎo)給藥雖然是很好的入腦載體,但并不適合臨床上的急性缺血的腦損傷的治療,因?yàn)槟X損傷后在很短的時(shí)間內(nèi)給藥才能對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞有保護(hù)和修復(fù)作用。而且病毒載體對(duì)人的免疫系統(tǒng),及細(xì)胞染色體組有副作用。
　　 ③用脂質(zhì)體包裹藥

4、物能增加藥物的脂溶性,但腦對(duì)脂質(zhì)體的攝入是絕對(duì)的和非特異性的,增加了藥物因全身分布而帶來(lái)的副作用和成本。
　　 ④單克隆抗體偶聯(lián)藥物進(jìn)行靜脈給藥能夠使得BDNF通過(guò)血腦屏障到達(dá)大腦而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),但這種方法得到的藥物,制備過(guò)程繁瑣,成本高:腦靶向用單克隆抗體需先進(jìn)行人源化改造。
　　 如何尋找一種有效的,非侵入性的給藥系統(tǒng)方法,使得BDNF進(jìn)入大腦發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)?
　　 來(lái)源于人免疫缺陷病毒的TAT蛋白能夠跨膜

5、導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部的發(fā)現(xiàn),給我們解決這個(gè)問(wèn)題提供了很好的思路。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)是指那些小于20個(gè)氨基酸、帶正電荷,可以穿過(guò)大多數(shù)細(xì)胞膜的穿膜肽的一個(gè)富含堿性氨基酸區(qū)域,帶正電荷的多肽片段與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相關(guān)聯(lián)。可以將大分子運(yùn)輸入幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),無(wú)需特殊的環(huán)境。其對(duì)給合物的大小沒(méi)有嚴(yán)格的限制,已經(jīng)在腫瘤,免疫治療等臨床前研究中取得了很大的進(jìn)展。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)基因工程方法制備了一種能通過(guò)血腦屏障的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-

6、PTD融合蛋白(BDNF-PTD),實(shí)驗(yàn)證明其能通過(guò)血腦屏障。在此基礎(chǔ)上,本文研究了BDNF-PTD在動(dòng)物腦缺血模型中保護(hù)神經(jīng)元功能的藥效學(xué)及其作用機(jī)制。
　　 目的：
　　 研究本實(shí)驗(yàn)中心制備的BDNF-PTD在動(dòng)物腦缺血模型中保護(hù)神經(jīng)元功能的初步藥效學(xué)功能；通過(guò)神經(jīng)功能缺陷評(píng)分對(duì)非給藥組和給藥組進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)價(jià)；研究本實(shí)驗(yàn)中心制備的BDNF-PTD在動(dòng)物腦缺血模型中保護(hù)神經(jīng)元功能的作用機(jī)制。
　　 方法<

7、br>　　 一、建立SD大鼠腦局部缺血模型
　　 大鼠用10％水合氯醛(3ml/100g)腹腔注射麻醉,仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上,在頸部正中切開(kāi),剪開(kāi)前筋膜,鈍性分離胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的間隙,暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)和迷走神經(jīng),并分離。往遠(yuǎn)心段找出頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA),干凈分離ECA、ICA。結(jié)扎ECA近分叉端和在距分叉處10mm結(jié)扎CCA,并在CCA近分叉處套線(xiàn)待用,用動(dòng)脈夾夾住ICA。在距分叉處5mm

8、的CCA上用眼科剪45。剪一小斜口,插入栓線(xiàn),通過(guò)分叉處進(jìn)入ICA,提起在CCA近分叉處準(zhǔn)備好的線(xiàn),打好結(jié)但不能太緊,栓線(xiàn)能通過(guò)為合適,松開(kāi)ICA處的動(dòng)脈夾,繼續(xù)使栓線(xiàn)順I(yè)CA入顱方向推進(jìn),直到推進(jìn)至分叉處17mm為止。將線(xiàn)栓和CCA固定,剪掉多余的栓線(xiàn),縫合筋膜和皮膚。
　　 根據(jù)Bederson評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷程度的評(píng)分。其原則如下:0分:無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀,行為正常；1分:前肢屈曲；2分:中度神經(jīng)功能缺損,抵抗對(duì)側(cè)推

9、力下降伴前肢屈曲,無(wú)轉(zhuǎn)圈行為；3分:重度神經(jīng)功能缺損,抵抗對(duì)側(cè)推力下降伴前肢屈曲,有轉(zhuǎn)圈行為。1、2、3級(jí)為模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 二、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對(duì)大鼠局灶性腦缺血治療作用的初步藥效學(xué)研究
　　 通過(guò)線(xiàn)栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(MACO)模型。永久性栓塞1個(gè)小時(shí)后腹腔給每只動(dòng)物模型注射50ug(50ug/=ml)的BDNF-PTD,24小時(shí)后斷頭取腦,大腦切片TTC染色,比較栓塞1小

10、時(shí)后給藥模型組與未給藥模型組的腦梗死面積,觀(guān)察BDNF-PTD保護(hù)大腦缺血神經(jīng)元死亡的情況。
　　 三、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對(duì)大鼠局灶性腦缺血治療作用的機(jī)制研究
　　 BDNF能提高神經(jīng)元抵抗缺血的能力,具有促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù),再生,調(diào)節(jié)神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重建,促進(jìn)腦損傷后認(rèn)知功能恢復(fù)等作用。其作用的機(jī)制可能與兩個(gè)主要的信號(hào)途徑有關(guān):磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)途徑和細(xì)胞分裂素(絲裂原)活化蛋白激

11、酶(MAPK/ERK)途徑。它們通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄蛋白(如cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白)而影響基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活。而促分裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇-3-激酶途徑都與BDNF-TrkB受體信號(hào)調(diào)節(jié)有關(guān)。我們研制的BDNF-PTD具有逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元死亡的功能,是否也是通過(guò)這些通路來(lái)發(fā)揮作用,這將在本課題研究中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 通過(guò)線(xiàn)栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型。永久性栓塞1個(gè)小時(shí)后腹腔給每只動(dòng)物模型注射50ug(5

12、0ug/ml)的BDNF-PTD,24小時(shí)后斷頭取腦蛋白,通過(guò)免疫印跡法(WB),驗(yàn)證BDNF-PTD是否可激活ERK1/2細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)。
　　 結(jié)果
　　 一、成功建立SD大鼠腦局部缺血模型
　　 大鼠大腦缺血模型制作后,栓塞24小時(shí)后,發(fā)現(xiàn)給藥組和未給藥模型組、陰性對(duì)照組,在神經(jīng)功能活動(dòng)上有不同的表現(xiàn)。根據(jù)Bederson評(píng)分法對(duì)每組模型進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷程度的評(píng)分,給藥組大

13、部分處于0到1分。而未給藥模型組及陰性對(duì)照組有抵抗對(duì)側(cè)推力下降伴前肢屈曲,和轉(zhuǎn)圈追尾運(yùn)動(dòng),大部分處于2到3分。
　　 二、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對(duì)大鼠局灶性腦缺血神經(jīng)保護(hù)治療作用的初步研究
　　 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型在栓塞1小時(shí)給藥,隨后24內(nèi)觀(guān)察大鼠偏癱癥狀,與未給藥模型組相比,給藥組大鼠偏癱癥狀得到明顯的改善。永久性栓塞24小時(shí)后,大腦冠狀切片TTC染色。梗死面積用Mean±SD表示,BDN

14、F-PTD給藥組與未給藥模型組、陰性對(duì)照組,比較結(jié)果有顯著性差別(F=26.791,P=0.000＜0.01)。發(fā)現(xiàn)1小時(shí)給藥模型組大鼠腦壞死區(qū)域面積與未給藥模型組相比明顯減少75％～80％。
　　 三、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對(duì)大鼠局灶性腦缺血治療作用的機(jī)制研究
　　 研究腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)對(duì)大鼠局灶性腦缺血治療作用的機(jī)制。在本課題中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,BDNF-PTD激活

15、ERK1/2,使其磷酸化,給藥模型組中pERK1/2蛋白表達(dá)水平較正常組均有顯著性升高(P<0.01)；與未給藥模型組中pERK1/2蛋白表達(dá)水平比較也均有顯著性升高(P<0.05)。
　　 另外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明,BDNF-PTD能上調(diào)PI3K,給藥模型組中PI3K蛋白表達(dá)水平較正常組均有顯著性升高(P=0.000<0.01)；與未給藥模型組中PI3K蛋白表達(dá)水平比較也均有顯著性升高(P=0.000<0.01)；而未給藥模型組與

16、正常組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論
　　 一、在大鼠腦缺血模型中,腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)能通過(guò)血腦屏障并且能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。跟未給藥模型組對(duì)比,顯示BDNF-PTD能很好的保護(hù)腦缺血后的神經(jīng)元。
　　 二、在大鼠腦缺血模型中,證實(shí)了腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子融合蛋白(BDNF-PTD)通過(guò)激活ERK細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的磷酸化和上調(diào)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),從而促進(jìn)神經(jīng)元