不同抗凝劑血液灌流對(duì)膿毒癥兔作用及安全性影響.pdf

1、背景:
　　 膿毒癥(sepsis)指由于外傷、化膿癥等各種原因?qū)е禄撔圆≡捌涠舅剡M(jìn)入血液后，并大量繁殖，迅速順著血液循環(huán)擴(kuò)散至宿的其他組織或器官，并在這些組織器官中產(chǎn)生新的化膿性病灶，最后導(dǎo)致劇烈全身炎癥反應(yīng)等嚴(yán)重的臨床綜合征，患者被感染后繼而出現(xiàn)機(jī)體內(nèi)各組織器官功能的障礙及受損，最終可引發(fā)如膿毒性休克(septicshock)、多器官功能衰竭(multipleorganfailure，MOF)等嚴(yán)重的并發(fā)癥，治療不及時(shí)

2、還能導(dǎo)致死亡。膿毒血癥如并發(fā)了重癥膿毒癥及膿毒性休克的死亡率可以高達(dá)70％。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家每年仍有超過70萬發(fā)生膿毒癥患者，死亡率約為30-50％。在我國(guó)，由于膿毒癥而出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥如多器官功能障礙綜合癥(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)而死亡的人數(shù)每年達(dá)到上百萬之多。如何有效應(yīng)對(duì)膿毒癥是受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。
　　 血液凈化(bloodpurification)是指把患者血液引出體外

3、并通過一種凈化裝置，除去其中某些致病物質(zhì)，凈化血液，達(dá)到治療疾病的目的，這個(gè)過程即為血液凈化。血液灌流(hemoperfusion，HP)治療技術(shù)將病人動(dòng)脈血流經(jīng)管道引向灌流器，血液經(jīng)過灌流器時(shí)受到吸附劑或其他生物材料的作用而得到凈化或生化處理，灌流后的血液再經(jīng)管路返回靜脈。HA型樹脂血液灌流器目前臨床上已廣泛用于膿毒癥病人的治療。
　　 過去研究一直認(rèn)為，凝血功能障礙及彌漫性血管內(nèi)凝血是膿毒血癥終末期所產(chǎn)生的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，然

4、而，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)膿毒血癥的發(fā)病過程中都存在這凝血功能障礙，而凝血功能障礙在膿毒血癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后所起重要作用的觀點(diǎn)受到研究人員的廣泛認(rèn)可。有研究顯示，超過50％的膿毒血癥患者伴有凝血因子數(shù)量或功能異常，DIC的發(fā)生率約為20％。因此，認(rèn)為對(duì)膿毒血癥患者的高凝狀態(tài)應(yīng)該及時(shí)早期糾正。
　　 但在膿毒癥行血液灌流哪種抗凝劑效果更佳?目前在國(guó)內(nèi)外尚無確定的答案。本文設(shè)想通過盲腸結(jié)扎穿孔法造成膿毒癥兔模型，然后根據(jù)使用抗

5、凝劑的不同，分組并分別對(duì)兔進(jìn)行單次血液灌流，檢測(cè)凝血酶原時(shí)間(prothrombintime，PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activatedpartialthromboplastintime，APTT)、凝血酶時(shí)間(thrombintime，TT)、纖維蛋白原(fibrinase，F(xiàn)IB)變化，并結(jié)合安全性，以找出膿毒癥兔血液灌流最佳抗凝劑，從而為臨床膿毒癥病人血液灌流治療的抗凝劑選擇提供一個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以期改善膿毒癥患者的預(yù)后。<

6、br>　　 目的:
　　 通過檢測(cè)兔血清中PT，APTT，TT，F(xiàn)IB隨血液灌流選擇抗凝劑不同而發(fā)生的變化，結(jié)合出血性事件，探討膿毒癥兔行血液灌流抗凝劑使用的最佳選擇。
　　 方法:
　　 1)準(zhǔn)備30只雄性實(shí)驗(yàn)兔，約2-2.5kg，購自南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為假手術(shù)組（6只）、手術(shù)組（6只）、水蛭素干預(yù)組（6只）、肝素干預(yù)組（6只）及枸櫞酸鈉干預(yù)組（6只）。
　　 2)運(yùn)用盲腸穿孔術(shù)制作

7、膿毒癥兔模型，對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行常規(guī)的消毒并鋪手術(shù)巾，行下腹部正中切口約3-5cm，打開腹壁進(jìn)入腹腔后將盲腸遠(yuǎn)端與大腸系膜分離，游離盲腸。暴露盲腸后，在盲腸基底部和盲腸游離端距離的中部結(jié)扎，保留近端盲腸血供，在盲腸末端與結(jié)扎部位之間的中部，用15號(hào)針頭(直徑2.5mm)沿腸系膜側(cè)向?qū)?cè)穿孔并來回貫穿3次。將盲腸放回腹腔原位，逐層縫合腹壁切口，術(shù)后皮下注射0.9％生理鹽水3mL，補(bǔ)充術(shù)中液體丟失。行股動(dòng)靜脈置管術(shù)以留待血液灌流的需要構(gòu)成血液管

8、路通道。
　　 3)各組在CLP術(shù)后12小時(shí)用自制血液灌流器行單次血液灌流，灌流時(shí)間為2小時(shí)，速度為5ml/min;假手術(shù)組行空灌流（用空灌流器灌流）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。手術(shù)組進(jìn)行造模和置管灌流，在管路預(yù)沖后不另行添加任何抗凝劑。肝素干預(yù)組，枸櫞酸鈉干預(yù)組及水蛭素干預(yù)組在血液灌流過程中分別應(yīng)用肝素鈉、枸櫞酸鈉和水蛭素，劑量分別為150IU/kg，2.5g/kg，3mg/kg，血液灌流中持續(xù)靜脈滴注。取造模前，灌流第0分鐘，灌流第10分

9、鐘，第30分鐘，第60分鐘，第120分鐘為時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)凝血-抗凝指標(biāo)PT，APTT，TT，F(xiàn)IB。
　　 4)兔固定在手術(shù)臺(tái)上至死亡，定時(shí)觀察兔精神、呼吸、心率、體溫情況，并每天靜脈補(bǔ)充液體，液體量按80ml/kg，包括0.9％生理鹽水及10％葡萄糖溶液，總張力為1/4，記錄生存時(shí)間記錄兔狀態(tài)，生存時(shí)間，有無出血事件。
　　 5)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSSI7.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)

10、的方差分析進(jìn)行處理，不滿足球形檢驗(yàn)時(shí)采用Greenhouse-Geisser校正，組間單獨(dú)效應(yīng)分析采用One-wayANVOVA，多重比較采用Dunnett檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1)進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后的動(dòng)物，處于嗜睡狀態(tài)，不進(jìn)食，刺激后可見痛覺反應(yīng)，6-12h出現(xiàn)精神萎靡，倦怠，對(duì)刺激反應(yīng)性減弱，毛發(fā)松亂等程度不同的中毒癥狀。術(shù)后約12小時(shí)均開始出現(xiàn)體溫升高，精神倦怠、呼吸、心率逐漸增

11、快等癥狀，均于術(shù)后48小時(shí)至90小時(shí)間死亡。初期脈搏為170-200次/min，呼吸為80-100次/min，進(jìn)而出現(xiàn)脈搏呼吸抑制，粘膜創(chuàng)口出血。死亡動(dòng)物尸解可見左下腹部出現(xiàn)膿腫包裹，腹腔有混濁滲出液，空腸充氣，甚至壞疽，盲腸腫脹、粘連，穿刺針孔明顯，肝、腎充血。CLP術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)(12h、24h)所取的血液細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本中均檢出大腸桿菌，陰性對(duì)照組細(xì)菌培養(yǎng)陰性。造模成功。
　　 2)盲腸結(jié)扎穿孔法建立動(dòng)物膿毒血癥模型后12小時(shí)開

12、始2小時(shí)的灌流，造模前各組間的凝血酶原時(shí)間(PT)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=6.721，P=0.101)，假手術(shù)組進(jìn)行開腹后縫合并置管，不對(duì)盲腸進(jìn)行結(jié)扎貫穿處理，僅作為陰性對(duì)照。手術(shù)組進(jìn)行造模和置管灌流，在管路預(yù)沖后不另行添加任何抗凝劑。造模后12h，灌流0分鐘再次測(cè)定凝血酶原時(shí)間，灌流各時(shí)間點(diǎn)僅假手術(shù)組無變化(F=0.820，P=0.547)，其余四組均顯著地升高(P＜0.001)，與假手術(shù)組比較，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);灌流第1

13、0分鐘，測(cè)定PT，手術(shù)組PT仍進(jìn)一步升高，達(dá)到33.72±3.05s，通過使用抗凝劑進(jìn)行灌流，肝素組PT下降最快、水蛭素次之、枸櫞酸鈉下降最慢，與手術(shù)組比較，均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);灌流第30分鐘，手術(shù)組PT為32.90±2.10s，各抗凝組PT值與手術(shù)組比較，均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);60分鐘與120分鐘兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，手術(shù)組發(fā)生灌流管堵塞，PT值無法檢測(cè)出來;三種抗凝劑都隨時(shí)間延長(zhǎng)而PT值縮小，肝素最為顯著，

14、而枸櫞酸鈉則相對(duì)作用較緩，除手術(shù)組外，其余組別無出現(xiàn)DIC現(xiàn)象。
　　 3)造模前各組間的血漿凝血酶時(shí)間(TT)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=11.809，P=0.100)，造模后12h，灌流0分鐘再次測(cè)定血漿凝血酶時(shí)間，灌流各時(shí)間點(diǎn)僅假手術(shù)組無變化(F=0.000，P=0.993)，其余四組均顯著地升高P＜0.001)，與假手術(shù)組比較，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001);灌流第10分鐘，測(cè)定TT，手術(shù)組TT仍維持于96s以上，通過使用抗

15、凝劑進(jìn)行血液灌流，肝素組TT下降最快，幅度最大、水蛭素組與枸櫞酸鈉組相近，下降幅度較小，與手術(shù)組比較，均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);灌流第30分鐘，手術(shù)組TT為96.95±10.48s，各抗凝組PT值與手術(shù)組比較，均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);60分鐘與120分鐘兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，手術(shù)組發(fā)生灌流管堵塞，TT值無法檢測(cè)出來;三種抗凝劑都隨時(shí)間延長(zhǎng)而TT值縮小，肝素最為顯著，而枸櫞酸鈉則相對(duì)作用較緩，除手術(shù)組外，其余組別無出現(xiàn)D

16、IC現(xiàn)象。
　　 4)造模前各組間的部分凝血活酶時(shí)間(APTT)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.962，P=0.446)，造模后12h，灌流0分鐘再次測(cè)定部分凝血活酶時(shí)間，灌流各時(shí)間點(diǎn)僅假手術(shù)組無變化F=2.882，P=0.035），其余四組均顯著地升高(P＜0.001)，與假手術(shù)組比較，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);灌流第10分鐘，測(cè)定APTT，除假手術(shù)組外，其余四組APTT仍維持于85s以上，通過使用3種不同抗凝劑進(jìn)行血液灌流，

17、肝素組APTT下降最快、水蛭素組與枸櫞酸鈉組相近，下降較慢，與手術(shù)組比較，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);灌流第30分鐘，手術(shù)組APTT為109.51±15.62s，3種不同抗凝劑組APTT值均下降到55s以下;60分鐘與120分鐘兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，手術(shù)組發(fā)生灌流管堵塞，APTT值無法檢測(cè)出來;三種抗凝劑都隨時(shí)間延長(zhǎng)而APTT值縮小，肝素最為顯著，而枸櫞酸鈉則相對(duì)作用較緩和，除手術(shù)組外，其余組別無出現(xiàn)DIC現(xiàn)象。
　　 5)造模

18、前各組間的纖維蛋白原(Fib)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.087，P=0.986)，造模后12h，灌流0分鐘采血測(cè)定纖維蛋白原，灌流各時(shí)間點(diǎn)僅假手術(shù)組無變化(F=0.205，P=0.957)，其余四組均顯著地升高(p＜0.001)，肝素組測(cè)得升高值最為顯著，為6.22±0.55g/L，與假手術(shù)組比較，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);灌流第10分鐘，測(cè)定Fib，除假手術(shù)組外，其余四組Fib仍維持于6.9-3.2g/L，通過使用3種不同抗凝劑

19、進(jìn)行血液灌流，肝素組Fib下降幅度最大、水蛭素組次之、枸櫞酸鈉組下降幅度最小，在3個(gè)加以抗凝劑組別中，肝素組仍為最高，但三者與手術(shù)組比較，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);灌流第30分鐘，手術(shù)組Fib為6.14±0.88g/L，肝素組Fib值下降到5.52±1.01g/L;60分鐘與120分鐘兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，手術(shù)組因凝血而灌流被迫中斷Fib值不測(cè);三種抗凝劑組都隨時(shí)間延長(zhǎng)而Fib值縮小，肝素最為顯著，在120分鐘時(shí)測(cè)得Fib為3.46±

20、0.73g/L，而枸櫞酸鈉作用最平緩，除手術(shù)組外，其余組別無出現(xiàn)DIC現(xiàn)象。
　　 6)灌流過程中，枸櫞酸組以及水蛭素組均無皮膚粘膜出血和（或）手術(shù)創(chuàng)口滲血，濾器無凝血;肝素組有1只手術(shù)創(chuàng)口滲血和1只粘膜出血（均注射魚精蛋白拮抗后恢復(fù)），濾器無凝血;手術(shù)組灌流過程中灌流器均因凝血而堵塞并導(dǎo)致蠕動(dòng)泵無法轉(zhuǎn)動(dòng)，灌流器停止工作，時(shí)間為44.45±13.27min。各組之間的動(dòng)物生存時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論