Survivin shRNA與大黃素聯(lián)合應(yīng)用抗卵巢癌治療實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中，卵巢癌(Ovarian cancer, OC)發(fā)病率居第二位，死亡率居首位。卵巢癌通常發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期，且患者易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致治療效果不理想，已成為女性生殖系統(tǒng)腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。隨著診斷手段的提高以及治療方法的進(jìn)步，卵巢癌患者病情獲得一定緩解，但總體預(yù)后并不理想，五年生存率仍低于50％，晚期患者不到30％。因此，卵巢癌的治療是婦科腫瘤學(xué)界面臨的一個(gè)重大難題和嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，迫切需要

2、尋找特異性強(qiáng)且患者能夠耐受的治療方法。
　　Survivin是凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族中的一員，它在細(xì)胞凋亡和分化中扮演重要角色，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的雙重功能，對(duì)細(xì)胞周期起調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)Survivin在成人分化成熟的正常組織中幾乎無表達(dá)，在胎盤、胸腺組織以及結(jié)腸上皮基底部細(xì)胞等快速分裂的正常細(xì)胞中少量表達(dá)，而在腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌、

3、淋巴瘤等大多數(shù)惡性腫瘤組織中高表達(dá)。 Survivin在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)特異性強(qiáng)而在正常組織不表達(dá)的特點(diǎn)，使它現(xiàn)已成為腫瘤診斷和治療的理想的靶點(diǎn)，如何靶向Survivin的治療成為近年來研究的熱點(diǎn)。
　　大黃素(Emodin)是一種蒽醌類物質(zhì)，是從大黃屬、寥屬、鼠李屬和番瀉葉中分離出來的主要有效單體。大黃素在臨床上具有多種藥理學(xué)活性，包括抗菌、抗炎、舒張血管、免疫抑制和抑制潰瘍形成等。近年來，大黃素的抗腫瘤作用逐漸成為研究的熱點(diǎn)。已

4、有研究發(fā)現(xiàn)大黃素能夠抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)凋亡，其中包括肝癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌和白血病等。
　　因此，本課題將靶向Survivin基因的腫瘤分子靶向治療技術(shù)與中藥治療相結(jié)合，探討靶向Survivin基因的短發(fā)夾RNA(small harpin RNA，shRNA)與大黃素聯(lián)合應(yīng)用抗卵巢癌治療的效果，旨在為抗卵巢癌治療提供客觀、科學(xué)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而為卵巢癌的臨床治療開辟有效的新途徑。
　　材料和方法：<

5、br>　　1.本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和HO8910。
　　2.構(gòu)建攜帶靶向Survivin基因的shRNA質(zhì)粒載體，通過脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染成功后，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)來檢測(cè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。
　　3.按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分組，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time PCR)技術(shù)觀察Survivin mRNA在不同組別中的表達(dá)水平。
　　4.通過蛋白質(zhì)印跡法(Weste

6、rn blot)檢測(cè)Survivin蛋白在不同組別中的表達(dá)水平。
　　5.通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，觀察Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與大黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
　　6.流式細(xì)胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與大黃素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)卵巢癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。
　　7.使用Transwell小室，通過細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

7、與大黃素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.倒置熒光顯微鏡下觀察Survivin shRNA質(zhì)粒在SKOV3和HO8910細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率約為60-70％。
　　2.Real timePCR結(jié)果顯示，Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SKOV3和HO8910細(xì)胞中Survivin mRNA表達(dá)水平明顯下降，與空白對(duì)照組比較差別明顯(P＜0.05)。
　　3.Western blot實(shí)驗(yàn)

8、結(jié)果顯示，Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SKOV3和HO8910細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)水平明顯下降，與real time PCR結(jié)果一致。
　　4.Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠有效降低卵巢癌細(xì)胞的增殖率，與空白對(duì)照組比較差別明顯(P＜0.05);大黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴模式，大黃素60μM組與空白對(duì)照組比較差別明顯(P＜0.05); Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與大黃素聯(lián)

9、合應(yīng)用能夠進(jìn)一步抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，與單藥應(yīng)用組差別顯著(P＜0.05)。
　　5.Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠明顯誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，大黃素60μM同樣具有誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用，與空白對(duì)照組相比差別顯著(P＜0.05); Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與大黃素聯(lián)合應(yīng)用能夠進(jìn)一步增加卵巢癌細(xì)胞的凋亡率，與單藥應(yīng)用組差別顯著(P＜0.05)。
　　6.在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，Transwell結(jié)果顯示

10、，Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與大黃素60μM均能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力，二者聯(lián)合應(yīng)用后卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力明顯被抑制，與單藥應(yīng)用組差別顯著(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，降低卵巢癌細(xì)胞的體外侵襲能力。
　　2.一定濃度的大黃素對(duì)能夠抑制卵巢癌生長(zhǎng)，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，降低卵巢癌細(xì)胞的體外侵襲能力。
　　3.S