黃鰭棘鯛rIL-1β生物學(xué)活性檢測及血清IgM的純化.pdf

1、本實驗室于2005年克隆了黃鰭棘鯛白細(xì)胞介素1β，并將推測的成熟肽基因序列插入原核表達(dá)載體pQE30，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞M15中，構(gòu)建了原核表達(dá)系統(tǒng)。在此基礎(chǔ)上，開展了黃鰭棘鯛白細(xì)胞介素1β生物學(xué)活性方面的研究。 對誘導(dǎo)表達(dá)后的重組蛋白采用Ni<'2+>-Chelating Sepharose FF層析技術(shù)進(jìn)行了純化，并采用梯度透析對純化蛋白進(jìn)行復(fù)性。結(jié)合對插入片段的測序結(jié)果以及WesternBlot可以確定，所純化的重組蛋白

2、即為重組白細(xì)胞介素1β(recombinant Interleukin1β，rIL-1β)。經(jīng)過Band Scan 5.0軟件分析，純化的rIL-1β純度達(dá)到95％。純化蛋白經(jīng)過離心超濾濃縮后，Bradford法測定其濃度為0.18mg/ml；經(jīng)鱟試劑檢測，純化蛋白的內(nèi)毒素含量小于0.964EU/ml。 采用Percoll不連續(xù)密度梯度離心分離黃鰭棘鯛頭腎白細(xì)胞，實驗證明，在分離液密度1.080g/ml的界面上富集的細(xì)胞中，白細(xì)

3、胞超過95％。將制備的頭腎白細(xì)胞進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，并用rIL-1β刺激培養(yǎng)的細(xì)胞，23℃培養(yǎng)4h后提取細(xì)胞的總RNA，用RT-PCR方法檢測到，當(dāng)培養(yǎng)基中rIL-1β的濃度達(dá)到20ng/ml時可以有效提高幾．1β基因的轉(zhuǎn)錄水平，與5μg/ml LPS的刺激效果相當(dāng)。 分別采用Sepharose-6B凝膠過濾層析、Phenyl Sepharose FF疏水作用層析和rProtein A Sepharose親和層析技術(shù)純化黃鰭棘鯛血

4、清IgM，并對這三種層析純化方法進(jìn)行了比較。純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)果掃描后經(jīng)Band Scan5.0軟件分析顯示：單獨使用Sepharose-6B凝膠過濾層析或Phenyl Sepharose FF疏水作用層析得到的IgM純度只有56％；兩者聯(lián)合使用可以達(dá)到69％，而rProtein ASepharose親和層析一步就可以達(dá)到89％的純度；純化得到的黃鰭棘鯛血清IgM的重鏈和輕鏈分子量分別為73.6KDa和26.5KDa。